Optisk detektering av<em> E. coli</em> Bakterier av Mesoporous Silicon Biosensors
Summary
En etikett-fri optisk biosensor för snabb bakteriedetektering införs. Biosensorn är baserad på en nanostrukturerad porösa Si, som är utformad för att direkt fånga målbakterien cellerna på dess yta. Vi använder monoklonala antikroppar, immobiliserade på det porösa transduktor, såsom infångningsproberna. Våra studier visar att tillämpningen av dessa biosensorer för detektion av låga bakteriehalter inom några minuter utan tidigare prov behandling (t.ex. cell-lys).
Abstract
En etikett-fri optisk biosensor baserad på en nanostrukturerade porösa Si är utformad för snabb uppsamling och detektion av Escherichia coli K12-bakterier, som en modell mikroorganism. Biosensorn förlitar sig på direkt bindning av målbakterien celler på sin yta, medan ingen förbehandling (t.ex. genom cellys) av den studerade provet krävs. En mesoporöst Si tunn film används som det optiska omvandlingselementet hos biosensorn. Under vitt ljus belysning, visar det porösa lagret väl löst Fabry-Perot fransmönster i sin reflektionsspektrum. Tillämpa en snabb Fouriertransform (FFT) till reflexionsuppgifter ger en enkel topp. Förändringar i intensiteten för den FFT peak övervakas. Således målbakterien fånga på biosensorytan, genom antikropp-antigen interaktioner, inducerar mätbara förändringar i intensiteten i FFT toppar, vilket möjliggör en "realtid" observation av bakterier fastsättning.
nt "> Den mesoporösa Si-film, tillverkad genom en elektrokemisk anodisering process, konjugeras med monoklonala antikroppar, specifika för målbakterierna. Immobiliseringen, immunoactivity och specificitet antikropparna bekräftas av fluorescerande märkningsexperiment. När Biosensor är utsatt för målbakterier cellerna direkt fångas upp på antikroppsmodifierade porösa Si-yta. Dessa specifika fångar händelser resulterar i intensitetsförändringar i tunnfilms optisk interferens spektrumet av biosensorn. Vi visar att dessa biosensorer kan detektera relativt låga bakteriehalter (detektions gräns på 10 4 celler / ml) i mindre än en timme.Introduction
Tidig och korrekt identifiering av patogena bakterier är oerhört viktigt för livsmedels-och vattensäkerhet, miljöövervakning, och point-of-care diagnostik 1. Som traditionell mikrobiologi tekniker är tidskrävande, mödosam, och saknar förmågan att detektera mikroorganismer i "realtid" eller utanför laboratoriemiljö, är biosensorer utvecklas för att möta dessa utmaningar 2-5.
Under de senaste åren har porös Si (PSI) vuxit fram som en lovande plattform för konstruktion av sensorer och biosensorer 6-20. Under det senaste årtiondet många studier kring PSI-baserade optiska sensorer och biosensorer publicerades 21,22. Den nanostrukturerade PSi Skiktet är normalt tillverkas genom elektrokemisk anodisk etsning från en enda kristall Si wafer. De resulte PSI nanomaterial uppvisar många fördelaktiga egenskaper, såsom stor yta och fri volym, por storlekar som kan styras och avstämbara optiniska egenskaper 10,16. De optiska egenskaperna av PSI skiktet, såsom fotoluminescens 8,11 och vitt ljusreflektion baserad interferometri 7,19, påverkas starkt av miljöförhållanden. Avskiljning av gästmolekyler / målanalyter inom det porösa skiktet resulterar i en förändring i den genomsnittliga brytningsindexet hos filmen, observeras som en modulering i fotoluminiscensspektrum eller som en våglängdsförskjutning i reflektiviteten spektrum 10.
Trots den stora innovationen i psi optisk biosensorteknologi, det finns bara några få rapporter om PSI-baserade plattformar för bakterier upptäckt 6,8,20,23-29. Dessutom har de flesta av dessa proof-of-concept studier har visat "indirekt" bakterier upptäckt. Sålunda är i allmänhet före lys av cellerna som krävs för att extrahera de riktade protein / DNA-fragment, karakteristiska för de studerade bakterier 29. Vår inställning är att direkt fånga målbakterienceller på Psi biosensor. Därför är monoklonala antikroppar, som är specifika för målbakteriema, immobiliserad på den porösa ytan. Bindning av bakterieceller, via antikropp-antigen-interaktioner på ytan av biosensorn inducera förändringar i amplituden (intensitet) av reflektiviteten spektrum 24-26.
I detta arbete, vi rapportera om att bygga en optisk PSi baserad biosensor och visa sin ansökan som en etikett-fri biosensing plattform för upptäckt av Escherichia coli (E. coli) K12 bakterier (som används som modell mikroorganism). Den övervakade optisk signal är det ljus som reflekteras från PSi nanostruktur på grund av Fabry-Perot tunn film interferens (Figur 1A). Förändringar i ljus amplitud / intensitet korreleras till specifik immobilisering av målbakterien celler på biosensorytan, vilket möjliggör snabb detektion och kvantifiering av bakterierna.
Protocol
Representative Results
Discussion
En etikett-fri optisk immunosensor, baserad på en PSiO 2 nanostruktur (en Fabry-Perot-tunnfilm) är framställd, och dess potentiella användbarhet som en biosensor för bakteriedetektering bekräftas.
Ändringar och felsökning
En av de största problemen när man utformar en immunosensor är känsligheten hos antikroppar att genomgå oönskade konforma förändringar under deponering och mönstring på det fasta underlaget, vilket kan leda till en mins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation (bidrag nr 1118-1108 och bidrag nr 1146/12) och Minna Kroll Memorial Research Fund. ES är mycket nöjd med ekonomiskt stöd från Russell Berrie Nanotechnology Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
References
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
