神经元中总钙含量的电子探针X射线微区分析测量法

摘要

本文描述了冷冻分析电子显微镜在生理学定义的生物样本中，以亚细胞分辨率对总钙含量及其分布进行定量测量的应用。

摘要

本文介绍了利用电子探针显微分析（EPMA）技术对细胞内元素含量进行定量测量所适用的工具、技术和仪器。由于线粒体钙超载在神经退行性疾病中具有关键作用，本文特别关注线粒体内钙的检测。该方法基于在电子显微镜（EM）中，电子束与样品相互作用所产生的X射线分析。为了在电子显微镜样品中保持可扩散元素的天然分布状态，EPMA要求 "冷冻固定" 组织的快速冷冻，随后制备超薄冷冻切片。培养细胞或类器官切片培养物的快速冷冻分别通过浸入液态乙烷或撞击冷冻至低温金属块上进行。使用金刚石刀在干燥条件下切割名义厚度为80 nm的冷冻切片 ca-160 °C下，置于碳膜/皮奥洛膜包被的铜网上，使用专用冷冻样品 holder 将样品冷冻转移至冷冻电镜中。在 ≤-160 °C 条件下以低电子剂量进行初步观察和位置定位后，将冷冻水合的冷冻切片在 -100 °C 下冷冻干燥约 30 分钟。利用慢扫描 CCD 相机以低剂量条件记录干燥后冷冻切片的细胞器水平图像，并选取感兴趣的亚细胞区域用于后续分析。通过固定、聚焦、高强度电子束照射样品，由能量色散 X 射线（EDX）谱仪收集感兴趣区域（ROIs）发射的 X 射线信号，经配套电子系统处理后生成 X 射线能谱图，即 X 射线强度随能量变化的图谱。配套软件可进一步实现：1）根据特征峰识别各元素成分 "特征" 峰值能量和指纹特征；以及通过提取峰面积/背景进行的定量分析。本文最后给出了两个实例，说明了电子探针显微分析（EPMA）的典型应用：其中一个实例通过线粒体钙分析为兴奋性毒性损伤机制提供了关键见解，另一个实例则揭示了缺血抗性的基础机制。

引言

钙离子可以说是生物学中最为重要且多功能的细胞信号分子，在突触传递和基因表达等多种正常生理过程中发挥着关键作用。另一方面，钙离子在细胞死亡过程中同样具有重要作用。特别是，钙稳态失调是中风、帕金森病、阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病中神经元损伤的关键因素^3,5。因此，定量理解钙离子在细胞内的分布方式，以及生理或病理刺激后这种分布如何变化，具有极其重要的意义。这一目标的实现较为复杂，原因在于钙离子在两种物理状态之间动态分布——游离于溶液中或与底物结合——并且细胞内钙浓度在受到刺激后会发生跨越多个数量级的变化。

尽管已有多种先进方法可用于游离细胞内钙的分析，但对特定细胞内区室中总钙浓度的测定实际上仅限于一种方法，即电子探针显微分析（EPMA）。EPMA 是一种将X射线光谱仪与透射电子显微镜（TEM）联用的技术。TEM的电子枪将一个固定的亚微米级电子束聚焦于感兴趣的亚细胞区域，由电子轰击引发的元素特异性X射线被收集并进行分析（详见参考文献^7,4的技术综述）。EPMA的优点包括单个细胞器水平的分辨率和亚毫摩尔级的检测灵敏度。然而在实际操作中，EPMA需要专门的低温技术及设备用于样品制备与分析。本文介绍了适用于采用EPMA测定细胞内钙含量的工具、技术和仪器。由于线粒体钙超载在神经退行性疾病中具有关键作用，线粒体内钙浓度尤其受到关注。

....

方案

本文所述方法基于特定的仪器、工具和软件开发而成。由于各实验室可能采用不同的实验装置，因此在可能的情况下，该方法已进行了通用化处理。

1. 快速冷冻

下述分析方法完全依赖于低温技术，主要体现在两个方面：1）以定量保存细胞或组织中可扩散组分及化学元素在冻结瞬间的分布状态为目标，对细胞或组织进行"冷冻固定"；2）制备适用于透射电子显微镜（TEM）成像与分析的超薄冷冻切片。此处仅简要描述这些技术，而其他实验室若要重复本实验流程所需的具体细节已超出本文范围。感兴趣的读者可参考近期优秀的相关文献^9,14。

注意：本节描述了液态乙烷的使用，液态乙烷高度易燃且可能爆炸；应采取适当预防措施。操作者还必须熟悉液氮（LN₂）的特性与安全操作规程。₂）安全防护措施，包括防护实验服、护目镜和耐低温手套。注意：此处及全文中，所有工具（镊子、 等等。用于处理冷冻样本的器械必须在液氮中预冷₂ 使用前避免意外解冻。

载玻片上的培养细胞

1. 通过在液氮中将气态乙烷冷却至 -160 °C 来制备冷冻固定装置₂冷却的中心井。使用时加液至刻度线，并在不使用时用可旋转的铝盖盖住井口。
2. 使用滤纸楔形片在....

结果

脑细胞通常在缺血条件下因病理性神经递质释放而遭受兴奋性毒性损伤。电子探针显微分析（EPMA）对于揭示神经元线粒体在损伤机制中封存大量钙离子的能力至关重要。下图电子显微照片中 图3 展示经兴奋性毒性刺激暴露30分钟后快速冷冻的培养海马神经元的冷冻干燥冷冻切片中线粒体的形态100 μM NMDA）。大多数线粒体在结构上似乎受到损伤，表现为显著肿胀并含有细小的深色包涵体（红色箭头）。电子探针显微分析（EPMA）具有足够的分辨率，可对线粒体包涵体内部以及排除包涵体之外的基质区域进行元素分析图3，分别对应红色和蓝色光谱）显示，这些包涵体主要由钙和磷组成。这些包涵体的钙含量极高，约为 1,300 mmol/kg 干重，而 <1 mmol/kg 是静息线粒体的典型水平——这解释了其卓越的钙缓冲能力，以及为何该缓冲机制被过度激活会导致钙超载引发的细胞死亡¹¹.

海马体是大脑中对学习和记忆至关重要的区域，也是缺血后主要的损伤部位。有趣且具有治疗意义的是，功能上 distinct 的 CA3 区域对缺血性损.......

讨论

基于电子显微镜的分析方法可实现对多种具有生物学意义的元素（包括 Na、K、P，尤其是 Ca）的检测、鉴定与定量。该分析可在亚细胞水平进行， 即，由于能够定位并鉴定从快速冷冻样品制备的冷冻超薄切片高质量图像中的目标结构，因而可实现细胞器内部的高分辨率观察。需要注意的是，即使在定量保存组织成分位置的情况下，也无需染色即可获得在结构质量上可与传统固定、树脂包埋样品相媲美的电子显微图像。

尽管结构扫描图像在低电子剂量下采集，但需要更高的剂量才能激发出足够计数率的X射线，以获得良好的统计结果。因此，适用于电子探针微区分析（EMPA）的显微镜必须能够形成高电流的聚焦电子束；将2–5 nA的电流聚焦至25–50 nm范围内，足以覆盖内质网池或突触囊泡等细胞器，此参数即可满足要求。这至少需要配备高亮度的六硼化镧电子枪。在此类仪器条件下，对于典型组织浓度为1–10 mmol/kg干重的钙，可在约100秒的实测时间内实现定量分析，标准误差为±0.1 mmol/kg。若非主要的钙X射线谱线与次要的钾谱线发生不幸重叠，钙分析的灵敏度将显著提高；该重叠使得钙信号积分过程中需进行解卷积处理，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂/材料
Thermanox 塑料盖玻片	赛默飞世尔科技	72280
培养插件	BD Falcon	353090	对于6孔板
冷冻针	徕卡显微系统	16701952	有凹槽的
木制涂抹棒	EM Sciences	72300
折叠电镜载网	Ted Pella	4GC100/100	100目
铟箔	Alfa Aesar	13982	0.25 mm 厚
<强>仪器设备
冷冻载网制备装置	徕卡显微系统	KF-80
Slam冷冻装置	LifeCell	CF-100
超薄切片机	徕卡显微系统	UC6
切片机用冷冻附件	Leica Microsystems	FC6
金刚石冷冻修块工具	硅藻	Cryotrim 45
金刚石冷冻刀	硅藻	Cryo 35
防静电装置	硅藻	豪夫静态绳
冷冻电子显微镜	卡尔·蔡司显微镜	EM912 Omega
EM 冷冻样品杆	Gatan	CT3500
慢扫描CCD相机，2k x 2k	特伦德尔（TRS）	Sharpeye
图像采集软件	奥林巴斯 SIS	iTEM 套件
ED X射线探测器	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
脉冲处理器	Oxford Instruments	XP-3
PCI背板卡	4pi 系统	Spectral Engine II
台式计算机	苹果	任何与 OS9 兼容的型号
X射线分析软件	NIST	DTSA，DTSA II
电子表格软件	微软	Excel
<李>CF100 已不再 commercially 销售，但许多学术机构仍配备该设备，且可在网络上找到完整的机器或零部件。 <李>CT3500 冷冻转移 holder 的视频教程可从以下网址获取： http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. <李>SEII 已停产；通用光谱引擎是一款后续推出的兼容 PC 的产品，具有类似功能。4pi 公司已停止制造和销售该系统，但仍提供技术支持。二手设备经常可在网络上找到。 <李>原始的DTSA现已过时。NIST在公共领域提供了其更新的继任版本DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)