Dette papir beskriver anvendelsen af cryoanalytical elektronmikroskopi til kvantitativ måling af total calcium indhold og fordeling på subcellulære opløsning i fysiologisk definerede biologiske prøver.
I denne artikel de værktøjer, teknikker og instrumenter er egnede til kvantitative målinger af intracellulære elementært indhold ved hjælp af teknik kendt som elektron probe mikroanalyse (EPMA) er beskrevet. Intramitochondrial calcium er særlig fokus på grund af den afgørende rolle, at mitokondrie calciumoverfyldning spiller i neurodegenerative sygdomme. Metoden er baseret på en analyse af røntgenstråler genereret på et elektronmikroskop (EM) ved interaktion af en elektronstråle med prøven. For at bevare den native fordeling af diffusible elementer i elektronmikroskopi prøver EPMA kræver "cryofixation" af vævet efterfulgt af fremstilling af ultratynde kryosektioner. Hurtig frysning af dyrkede celler eller organotypiske skive kulturer udføres ved springet frysning i flydende ethan eller af slam frysning mod en kold metalblok, hhv. Kryosektioner nominelt 80 nm tyk skæres tør med en diamant kniv ved ca. -16076; C, monteret på carbon / pioloform-belagt kobber net, og cryotransferred ind i en cryo-EM bruge en specialiseret cryospecimen holder. Efter visuel undersøgelse og placering kortlægning ved ≤ -160 ° C, og lav elektron dosis frosne hydreret kryosektioner frysetørres ved -100 ° C i ~ 30 minutter. Organel-level billeder af tørrede kryosektioner registreres også ved lav dosis, ved hjælp af en langsom-scan CCD-kamera og subcellulære regioner af interesse udvalgt til analyse. X-stråler, der udsendes fra ROIs ved en stationær, fokuseret, høj intensitet elektron probe indsamles af en energi-Dispersive X-ray (EDX) spektrometer, behandles af hørende elektronik, og præsenteres som en X-ray spektrum, der er en plot af røntgen intensitet vs energi. Yderligere software letter: 1) identifikation af elementært komponenter ved deres "karakteristiske" peak energi og fingeraftryk, og 2) kvantitativ analyse ved ekstraktion af toparealer / baggrund. Dette papir slutter med to eksempler, der illustrerer typiskeEPMA applikationer, et, hvor mitokondrie calcium analysemetoder kritisk indsigt i mekanismerne for excitotoksisk skade og en anden, der afslørede grundlag af iskæmi modstand.
Calciumioner er nok den vigtigste og mest alsidige cellesignalering enhed i biologi, spiller en væsentlig rolle i normale processer så forskellige som synaptisk transmission og genekspression. På den anden side, calcium er lige så vigtigt i celledød. Især calcium deregulering er en nøglefaktor i neuronal skade i slagtilfælde, Parkinsons, Alzheimers og andre neurodegenerative sygdomme 3,5. Således er det kritisk vigtigt at forstå kvantitativt hvor calcium er fordelt inden for celler, og hvordan dette ændrer følgende fysiologiske eller patofysiologiske stimuli. Dette mål kompliceres af, at calcium dynamisk fordeles mellem to fysiske tilstande – fri i opløsning eller bundet til et underlag – og det cellulære calciumkoncentrationerne ændre sig over flere størrelsesordener som følge af stimulation.
Mens der er flere avancerede metoder til rådighed for analyse af free intracellulært calcium, er bestemmelse af total calciumkoncentrationer i bestemte intracellulære realistisk begrænset til en fremgangsmåde, nemlig elektron probe mikroanalyse (EPMA). EPMA er en teknik, at par et røntgenbillede spektrometer til et transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM elektronkanon fokuserer en stationær, submicron elektron sonde på en subcellulær område af interesse og det element-specifikke X-stråler, der udsendes som et resultat af elektron bombardement er indsamlet og analyseret (se referencer 7, 4 til detaljerede tekniske anmeldelser). Fordele ved EPMA omfatter enkelt organel niveau opløsning og submillimolar følsomhed. I praksis er det dog EPMA kræver specialiserede cryotechniques og instrumenter til prøvepræparation og analyse. Her er de værktøjer, teknikker og instrumenter er egnede til måling af intracellulær calcium hjælp EPMA beskrevet. Intramitochondrial calcium er af særlig interest på grund af den afgørende rolle, at mitokondrie calciumoverfyldning spiller i neurodegenerative sygdomme.
Den elektronmikroskop-baserede analysemetode præsenteres her giver mulighed for detektion, identifikation og kvantificering af flere elementer af biologisk interesse, herunder Na, K, P og især Ca. Disse analyser kan udføres på subcellulært, dvs intra-organel, opløsning på grund af muligheden for at lokalisere og identificere strukturer af interesse i billeder af kryosektioner fremstillet af hurtigt frosne prøver af høj kvalitet. Bemærk, at ingen farvning er forpligtet til at optage elektron billeder s…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Ms Christine A. Winters for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Basic Neuroscience Program for NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS002610).
REAGENTS/MATERIALS | |||
Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
EQUIPMENT | |||
Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|