Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires In Vivo

Résumé

Une approche biochimique est décrite in vivo pour identifier les interactions protéine-protéine dans (PPI) de protéines membranaires. Le procédé combine la réticulation des protéines, purification par affinité et la spectrométrie de masse, et peut être adapté à presque n'importe quel type de cellule ou un organisme. Avec cette approche, même l'identification des IPP transitoires devient possible.

Résumé

Les protéines membranaires sont essentielles pour la viabilité des cellules et sont donc des cibles thérapeutiques importantes ^3.1. Comme ils fonctionnent dans des complexes ^4, méthodes pour identifier et caractériser leurs interactions sont nécessaires ^5. À cette fin, nous avons développé l'expérience d'interaction Strep-protéine de membrane, appelée membrane-SPINE ^6. Cette technique combine in vivo de réticulation réversible à l'aide du formaldéhyde agent de réticulation avec une purification par affinité de la protéine d'appât de la membrane à étiquette Strep. Au cours de la procédure, les protéines de proies réticulés sont co-purifiés avec la protéine appât de la membrane et ensuite séparées par ébullition. Ainsi, deux grandes tâches peuvent être exécutées lors de l'analyse des interactions protéine-protéine (IPP) de protéines membranaires en utilisant membrane-SPINE: d'abord, la confirmation d'un partenaire d'interaction proposé par immunoblot, et d'autre part, l'identification de nouveaux partenaires d'interaction par spectrométrie de masse . En outre, même low affinité, les IPP transitoires sont détectables par cette technique. Enfin, Membrane-SPINE est adaptable à presque n'importe quel type de cellule, qu'il s'applique à un outil de dépistage pour identifier des IPP de protéines membranaires.

Introduction

Pour comprendre la fonction d'une protéine, il est essentiel de connaître ses partenaires d'interaction. Plusieurs techniques classiques sont disponibles pour l'identification des partenaires d'interaction de protéines solubles. Cependant, ces techniques ne sont pas facilement transférables à des protéines membranaires du fait de leur nature hydrophobe ^4. Pour contourner cette limitation, nous avons développé la membrane Strep-protéine interaction expérience (Membrane-SPINE) ^6. Il est basé sur la méthode de la colonne vertébrale, qui était uniquement pour les protéines solubles ^7.

Membrane-....

Protocole

Remarque: Les informations détaillées concernant les tampons indiquées dans le protocole est disponible dans le tableau 1.

Une. Fixation des interactions protéine-protéine par formaldéhyde réticulation dans les cellules vivantes

1. Pour commencer la préparation des milieux de culture, solutions mères et de tampon P1
   1. Préparer 500 ml de milieu: Le milieu doit offrir des conditions qui favorisent l'interaction entre les protéines membranaires de protéines appâts et proies. En outre, une expérience doit être réalisée dans des conditions où l'on prévoit aucune interaction (par exemple, sans ré....

Résultats

Analyse membrane RACHIS permet la co-purification des protéines membranaires et interagissant de manière transitoire partenaires protéiques. La co-purification est réalisée en utilisant l'agent formaldéhyde transversale de liaison. Deux paramètres sont critiques pour éviter des liaisons transversales non spécifiques: la concentration en formaldéhyde et le temps de réticulation. L'utilisation suffisante, mais non excessive de formaldéhyde peut être facilement contrôlé par immuno. Complexes protéiques formaldéhyde réticul.......

Discussion

Analyse membrane colonne vertébrale est une approche biochimique que l'on permet de confirmer et d'identifier à ce point inconnus partenaires d'interaction de protéines membranaires. Membrane SPINE combine in vivo réticulation par le formaldéhyde à la purification d'une protéine appât de membrane Strep-marqué. La combinaison avec des immuno-empreinte facilite la confirmation de partenaires d'interaction prédites (Figure 2). En outre, la combinaison avec l'analyse MS perm.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
37 % Formaldéhyde	Roth	4979.1	Ne doit pas avoir plus d’un an
DNaseI	Sigma	DN25
BCA kit de dosage des protéines	Pierce	23225
Tige micromagnétique	Roth	0955.2	5 mm de longueur, 2 mm de diamètre
Triton X-100	Roth	6683.1	détergent standard pour la solubilisation
n-Dodecyl-&beta ;-maltoside	Glycon	D97002-C	le meilleur détergent pour solubiliser CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow colonne d’écoulement par gravité	IBA	2-1207-050
Kit de tampons de purification de protéines streptococciques	IBA	2-1002-001	Contient le tampon W et le tampon E
Filtre centrifuge Amicon Ultra-4	Millipore	UFC803024
Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico	Pierce	34080
SilverQuest Kit de coloration à l’argent	Invitrogen	LC6070
FireKit de coloration à l’argent	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge