효모 Luminometric 및<em> Xenopus의</emTRPV4의 분자 Mechanosensitivity의> 난자 전기 생리 시험
Summary
TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + – 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 – 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.
Abstract
TRPV4 (과도 수용체 잠재력, 바닐 로이드 가족, 유형 4) 널리 척추 동물의 조직에서 발현되고, 기계적인 힘에 의해 등 여러 가지 자극에 의해 활성화된다. 특정 TRPV4 돌연변이는 인간의 복잡한 유전 뼈 또는 신경 병리의 원인이됩니다. 야생 형 또는 돌연변이 TRPV4 도입 유전자는 일반적으로 배양 된 포유 동물 세포에서 발현과의 Fura-2 형광 측정에 의해 전극에 의해 검사된다. mechanosensitivity 및 질병의 분자 염기의 메커니즘의 측면에서, 현재 문헌들은 혼란과 논란이있다. 기존의 방법을 보완하기 위해, 우리는 TRPV4의 분자 특성을 검사하는 두 가지 추가 방법을 설명합니다. (1) 쥐 TRPV4 및 애큐 오린의 유전자는 신진 효모로 변환된다. 형질 전환 체 인구의 저자 osmtic 충격 TRPV4 채널을 통해 발표로 인해 칼슘 2 +와 애큐 오린의 조합에 luminometric 신호를 얻을 수 있습니다. 여기 TRPV4는 평소 포유류의 파트너 단백질로부터 분리자체 mechanosensitivity을 보여준다. (2) TRPV4의 된 cRNA는 Xenopus의 난자에 주입된다. 배양의 적당한 기간 후에 거시적 TRPV4 전류는 두 전극 전압 클램프로 검사된다. 난자 화장실에서 불활성 농도의 삼투압의 제거시 현재의 상승은 mechanosensitivity 나타낸다. 난자에서 마이크로 암페어 (10-6 10-4) 전류는 명확 quantifications과 자신감 평가를 항복, 배양 된 세포에서 nanoAmpere subnano 대 (10 -10 -9 10) 전류보다 훨씬 크다. 개별 채널 단백질의 활동을 반영 미세한 전류가 직접 온 셀 또는 절제 모드에서, 패치 클램프에 따라 등록 될 수있다. 같은 난자는 더 나은 데이터 복제를 허용, 여러 패치 샘플을 제공합니다. 패치에 적용 흡입구 직접 mechanosensitivity을 평가하기 위해 TRPV4을 활성화 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 TRP 채널의 다른 유형의 연구에 유용 할 것이다.
Introduction
TRPS (일시적 수용체 전위) 감각 기능 1,2를 제공 양이온 채널의 일곱 아과을 포함한다. 포유 동물, TRPV에서 TRPS의 바닐 로이드 아과는 6 종류가 있습니다. TRPV4 (유형 4) 가열 3,4에 응답, 특정 화학 물질, 삼투압 부종, 또는 전단 응력. TRPV4 유전자 반복 후보 유전자 및 / 또는 5-8 클로닝 식에 의해 단리 하였다. 후자의 방법은 저자 삼투압에 유전자 산물의 응답을 하였다. TRPV4 많은 상이한 세포 유형 3,4의 개발, 생리학, 병리 또는 거의 모든 기관 및 함수로 표현된다.
눈에 띄는 말초 신경 병증 및 / 또는 골격 이형성증 (골격 발달에 이상) 9-11을 일으키는 원인이되는> 50 인간의 염색체 우성 TRPV4 돌연변이입니다. 골격 이형성증의 범위는 가벼운 brachyomia 유형 3 (유형 3 왜소증), spondylometaphyseal 발육 코즐로 스키 형, 세 베리까지이형성증 다시, 일부는 신생아 또는 배아의 죽음을 초래. 메커니즘의 모든 방식이 가능한 것 같다 있지만, 아무도 다양성, 복잡성, 다양성, 이러한 질병 4 가끔 중복 설명하지 않습니다.
다른 TRP 채널 1과 마찬가지로, TRPV4는 사량입니다. 쥐 또는 인간의 TRPV4, 각각의 서브 유닛은 871 잔기로 구성되어있다. 그 중심 요소는 여섯 횡단 가능성 전압 문 K + 채널과 유사한 방식으로 배치되어 나선 (S1-S6)이다. 거기에, S4에 S1은 주변 영역을 형성하고, S5 및 S6은 투과 기공 도메인을 형성한다. S5와 S6 사이의 TRPV4 아마도 양이온 필터를 형성하도록 수렴 중 네 시퀀스 LDLFKLTIGMGDL,이어서 짧은 기공 나선이다. 470 – 잔류 N-말단 세포질 세그먼트는 단백질이나 작은 리간드를 결합하는 것으로 알려져 6 ankyrin 반복이 포함되어 있습니다. C-말단 152-잔류 세포질 부분은 구약 바인딩 가능한 다른 사이트들 사이에 칼 모듈 린 결합 순서를 포함그녀의 요소 3.
TRPV4 본질적 음이온 일을 제외 양이온 채널이다. 생리 학적 기능은 칼슘 2 + 유입 자극을 형질 도입하는 것이지만, 그것은 P 캘리포니아에서 이가 호의를, 또한 아이젠만 IV 투과성 순서와 다른 양이온을 투과 : P 나 7 ~ 12. 단일 채널 컨덕턴스 ~ 90 피코 초 외부와 ~ 40 피코 초 안쪽 6,13,14에 정류한다. 발현 된 (아래) 현재는 저자 삼투 부종, 전단 응력, 또는 온기 (15)에 의해 활성화 될 수 있습니다. 또한 고도 불포화 지방산 (16, 17) 및 합성 phorbal 에스테르 18 4αPDD에 의해 활성화된다. 현재, 모두가 높은 처리량, 작은 분자 화면에 의해 발견, 10-9 10-8 M (20)의 효과가 가장 강력한 효능은 GSK1016790A 19과 길항제 GSK2193874입니다.
TRPV4 연구의 두 가지 핵심 영역은 혼란 남아(1) TRPV4 크게는 mechanosensitivity 공부하더라도으로, 분자 기초는 논쟁의 여지가있다. 한 모델은, 저자 삼투압 어떻게 든 epoxygenase에 의해 산 (EET)를 epoxyeicosatrienoic로 변환되는 고도 불포화 지방산 (PUFA) 아라키돈 산 (AA)을 생산하는 포스 포 리파아제 A2 (PLA2)를 활성화하고 EET의 결합이 TRPV4 16를 활성화 설명 17. 그러나, TRPV4 자체가 직접 간단한 설명을 제공하는 멤브레인 스트레칭 14 (아래)에 대응하기 위해 표시되었습니다. (2) TRPV4 돌연변이 병리 어지러 울 수 있습니다. 기초에, 하나는 질병 손실, 감소 또는 채널 활동의 증가에 기인하는지 여부를 알 필요가있다. 여기에서도, 문학은 명확하지입니다. 여러 골격-이형성증의 대립 유전자는 높은 활성을 가지고보고있는 동안, (이득의 기능, GOF) 4,21은 여러 가지가 활동 (기능 상실, LOF) 10,22을 감소하는 것으로보고되었다. 14 대립 유전자의 체계적인 연구에 발견모든 GOF 수 변이 (아래) 23. TRPV4 기능의 전체 손실에도 불구하고 사소한 결함이 가능한 또는 비옥 녹아웃 마우스,,, – 일부는 LOI들입니다 주장은 trpV4 – /의 표현형을 부정하는 것 같습니다.
이러한 논쟁의 일부는 방법 론적 기원을 가지고 있습니다. 연구소는 다른 방법, 또는 방법의 변형을 사용하고, 다른 심사 기준을 사용한다. 가장 일반적으로, TRPV4는 일시적으로 (HEK, CHO, 헬라) 및 작용제 또는 저장성 자극에 따라 내부 [칼슘 2 +]의 증가는 칼슘 2 +에 민감한 형광 염료의 Fura-2에 등록되어 배양 된 포유 동물 세포에서 발현된다. 이 형광 분석에 과다 의존은 1 비판을 받아왔다. 다른 집단에서 발현 수준은 그 내부에 분포뿐만 아니라 효과적인 염료 농도가 제어되고 기록되어야 할 필요가있다. 보다 안정적인는 직접 전기 생리학 검사입니다. 심지어이 같은 commonly는 연습, 문제없이도 없습니다. 개별 배양 세포에서 발현 수준은 제어가 곤란하기 때문에, 전체 – 셀 전류가 큰 변동이있다. 전류가 작기 때문에 또한, 신뢰할 수있는 통계는 종종 실용적이지 큰 샘플 크기에 의존해야합니다. 패치 클램프 검사는 거의 수행되지 않았습니다. 일부 이러한 기록은 16, 17 통계적 평가는 도전하게 활동 버스트의 클러스터를 보여줍니다.
더 나은 분자 mechanosensitivity을 이해하기 위해, 우리는 TRPV4을 검사하는 두 개의 추가 시스템을 개발했습니다. (1) 거리의 보통 포유류의 파트너 TRPV4를 분리하기 위해, 우리는 효모 (24) 신진에 쥐 TRPV4을 표명했다. 이 진화 적으로 먼 상황에서 TRPV4의 기능적 발현은 여전히 평소 파트너없이 침투 힘에 응답 할 수 있음을 보여 주었다. 효모는 AA 또는 EET으로 더 된 PUFA를하지 않으며, 게놈이 간편 체크인을 더 PLA2 또는 epoxygenase 유전자가 없기 때문에(투약) 소지도 TRPV4는 힘을 감지하기 위해 그들이 필요하지 않습니다 것을 보여줍니다. 분자 생물학적으로 가장 의무가 진핵 생물에서 TRPV4를 갖는 것은 또한 효율적인 앞으로 또는 역방향 유전자 조작 25 수 있습니다. (2) TRPV4의 깊이있는 생물 물리학 적 분석을 위해, 우리는 Xenopus의 난자에 TRPV4을 표명했다. nA의 (10 -10 10 -9 A)의 전류로 서브 – 나를 얻을 배양 된 세포와 달리 난자 μA의 (10-6 10-4)의 전류를 표현한다. 소음에 훨씬 더 큰 신호가 더 나은 정량화하고 자신감 비교를 할 수 있습니다. TRPV4, 그래서 표현도 패치 클램프를 사용하여 개별 분자로 검사 할 수 있습니다. 하나의 난자가 다시 정량보다 안정적 만들기, 반복 패치 샘플링을 할 수 있습니다. 이러한 연구는 TRPV4 채널 자체가 직접 막 스트레치 힘 (14)에 의해 활성화 될 수있는 것으로 나타났다. 분석은 14 대표 골격-발육 대립 유전자는 모든 기능 획득 돌연변이 있다는 것을 보여 주었다. 또한, degr이 제정 칼슘 2 + 누설의 EE는 골격 질환 (23)의 심각도를 평행.
때문에 그들의 참신 및 유용성,이 두 가지 방법의 상세한 절차는 TRPV4 또는 유사한 채널에서 미래의 연구에 복제 할 수 있도록 여기에 조립된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
서론에서 언급 한 바와 같이, 일반적으로 TRPV4 기능을 연구하는 데 사용되는 방법은 때때로 모순과 논쟁의 결과. 여기에 설명 된 방법 중 두 세트의 몇 가지 장점을 제공하며, 기존의 방법을 보완 할 수있다. 우리가 TRPV4 만의 연구를 설명하는 동안, 방법은 다른 이온 채널을 연구하기 위해 확장 될 수있다.
1. 효모 Luminometry 방법
신진 효모 지질 조성물 (3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우수한 기술 지원을 안드레아 Kremsreiter에게 감사의 말씀을 전합니다. 매디슨 – 우리 실험실에서 작업 NIH GM096088와 위스콘신 대학의 빌라스들에게 지원됩니다.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
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