Gær luminometriske og<em> Xenopus</em> Oocyte elektrofysiologiske Undersøgelser af Molekylær Mechanosensitivity af TRPV4
Summary
Som supplement til almindeligt anvendte metoder til at studere TRPV4 s er to metoder beskrevet: Dens mechanosensitivity kan studeres af Ca 2 +-aequorin-luminometri i transgene gær ved hypo-osmotisk udfordring. Det kan også undersøges i TRPV4-RNA injicerede Xenopus oocytter ved hel-celle to-elektrode spænding klemme eller patch clamp i on-celle eller fjernede tilstand.
Abstract
TRPV4 (Transient Receptor Potentialer, vanilloid familie, type 4) er almindeligt udtryk i hvirveldyr væv og aktiveres af flere stimuli, bl.a. ved hjælp af mekaniske kræfter. Visse TRPV4 mutationer forårsager kompleks arvelig knogle eller neuronale patologier i menneskelig. Vildtype-eller mutant TRPV4 transgener almindeligvis udtrykkes i dyrkede pattedyrceller og undersøges af Fura-2 fluorometri og elektroder. Med hensyn til mekanismen for mechanosensitivity og molekylære grundlag for de sygdomme, den nuværende litteratur er forvirrende og kontroversiel. Som supplement til de eksisterende metoder beskriver vi yderligere to metoder til at undersøge de molekylære egenskaber TRPV4. (1) Rat TRPV4 og en aequorin transgen omdannes til spirende gær. En hypo-osmtic chok transformantens befolkning giver et luminometrisk signal på grund af kombinationen af aequorin med Ca 2 +, frigivet gennem TRPV4 kanal. Her TRPV4 er isoleret fra sine sædvanlige pattedyr partner proteinerog afslører sin egen mechanosensitivity. (2) cRNA af TRPV4 injiceres i Xenopus-oocytter. Efter en passende inkubationstid, er den makroskopiske TRPV4 aktuelle undersøgt med en to-elektrode spændingsklemme. Den aktuelle stigning på fjernelse af inaktive osmotikum fra oocyt bad er tegn på mechanosensitivity. De mikroampereområdet (10 -6 til 10 -4 A) strøm fra oocytter er langt større end de subnano-til nanoampere (10 -10 til 10 -9 A) strøm fra dyrkede celler, hvilket giver klarere kvantificeringer og mere fortrøstningsfulde. Mikroskopiske strømme afspejler aktiviteterne i de enkelte kanalproteiner kan også direkte registreret under en patch clamp, i on-celle eller fjernede tilstand. Det samme oocyt giver flere patch prøver, så der bedre data replikation. Sugerør anvendes på patches kan aktivere TRPV4 til direkte at vurdere mechanosensitivity. Disse metoder bør også være nyttige i studiet af andre typer af TRP kanaler.
Introduction
TRP (forbigående receptor potentialer) omfatter syv underfamilier af kationkanaler der tjener sensoriske funktioner 1,2. I pattedyr, TRPV den vanilloid underfamilie af TRP, har seks sorter. TRPV4 (type 4) 3,4 reagerer på varme, visse kemikalier, osmotisk hævelse eller shear stress. Den TRPV4 genet blev gentagne gange isoleres ved kandidat-genet og / eller ekspressionskloning 5-8. Sidstnævnte metode efterfulgt genproduktet reaktion på hypo-osmolaritet. TRPV4 udtrykkes i næsten alle organer og funktioner i udvikling, fysiologi, eller patologi mange forskellige celletyper 3,4.
Slående er de> 50 menneskelig autosomal dominant TRPV4 mutationer, der forårsager perifere neuropatier og / eller skelet dysplasier (abnormiteter i skelet udvikling) 9-11. De skelet dysplasier spænder fra mild brachyomia type 3 (type-3 dværgvækst), spondylometaphyseal dysplasi Kozlowski typen, at Severe dysplasier, nogle forårsager neonatal eller fosterdød. Selv synes muligt alle manerer af mekanismer, ingen forklarer mangfoldighed, kompleksitet, variation og lejlighedsvise overlapninger af disse sygdomme 4.
Ligesom andre TRP kanaler 1, TRPV4 er en tetramer. I rotte eller menneske TRPV4 er hver underenhed bestod af 871 rester. Dens centrale element er den seks transmembrane et helices (S1-S6), som sandsynligvis arrangeret på en måde, der svarer til spændingsåbnede K +-kanaler. Der S1 til S4 danner en perifer domæne og S5 og S6 danner gennemtrængning pore domæne. Mellem S5 og S6 TRPV4 er en kort pore helix efterfulgt af sekvensen LDLFKLTIGMGDL, hvoraf fire formentlig konvergere til dannelse af kationen filteret. Den 470-rest N-terminal cytoplasmatisk segment indeholder 6 ankyrin gentagelser, der er kendt for at binde proteiner eller små ligander. Den C-terminale 152-rest cytoplasmatisk segment omfatter en calmodulin-bindende sekvens blandt andre brancher, der binder othendes elementer 3.
TRPV4 er en kation kanal, der hovedsagelig udelukker anioner 1. Mens dets fysiologiske funktion er at transducere stimuli Ca2 + indstrømning, er det også permeabelt for andre kationer med en permeabilitet sekvens Eisenman IV begunstige divalent til en P Ca: P Na ~ 7 12. Single-kanals ledningsevne afhjælper på ~ 90 pS udad og ~ 40 pS indad 6,13,14. Heterologt udtrykt strøm (nedenfor) kan aktiveres ved hypo-osmotisk hævelse, forskydningsspænding eller varme 15. Det er også aktiveres af polyumættede fedtsyrer 16,17 og syntetiske phorbal ester 4αPDD 18. På nuværende tidspunkt er den mest potente agonist GSK1016790A 19 og antagonisten er GSK2193874 effektiv i 10 -9 10 -8 M 20, begge opdaget af high-throughput, lille molekylvægt skærm.
To centrale områder af TRPV4 forskning forblive forvirrende: (1) Selv som TRPV4 vid udstrækning er undersøgt for sin mechanosensitivity, dens molekylære grundlag er kontroversiel. En model beskriver hypo-osmolaritet måde aktiverer phospholipase A2 (PLA2) at producere polyumættet fedtsyre (PUFA) arachidonsyre (AA), som omdannes til epoxyeicosatrienoic syre (EET) af en epoxygenase og bindingen af EET aktiverer TRPV4 16. 17.. Alligevel har TRPV4 selv blevet vist at direkte svare membran stretch 14 (nedenfor), hvilket giver en enklere forklaring. (2) TRPV4 mutant patologier er forvirrende. På fundamentet, er man nødt til at vide, om de sygdomme skyldes tab, reduktion eller forøgelse af kanal-aktiviteter. Selv her, litteraturen er langt fra klart. Mens flere skelet-dysplasi alleler blev rapporteret til at have højere aktiviteter (gain-of-funktion, GOF) 4,21, adskillige blev rapporteret at have reduceret aktiviteter (tab af funktion, LOF) 10,22. En systematisk undersøgelse af 14 alleler fandt dem tilalle skal GOF mutationer (nedenfor) 23. Påstanden om, at nogle er LOF synes at modsige den fænotype TRPV4-/ – knockout-mus, som er levedygtige eller frugtbar, med kun mindre fejl, på trods af en fuldstændig tab af TRPV4 funktion.
En del af disse kontroverser har metodologisk oprindelse. Laboratorier anvender forskellige metoder, eller varianter af en fremgangsmåde og anvende forskellige dømme standarder. Mest almindeligt er TRPV4 forbigående udtrykkes i dyrkede pattedyrceller (HEK, CHO, HeLa) og fremkomsten af intern [Ca 2 +] ved agonist eller hypotonisk stimulation er registreret med Ca 2 + fluorescensfarvestof, Fura-2. De over-afhængighed af denne fluorometrisk assay er blevet kritiseret 1. Ekspressionsniveauet i forskellige populationer, fordelingen deri, såvel som den effektive farvestofkoncentration, skal kontrolleres og dokumenteres. Mere pålidelig er de direkte elektrofysiologiske undersøgelser. Selv dette som commonly praktiseres, er heller ikke uden problemer. Fordi ekspressionsniveauer i individuelle dyrkede celler er vanskelige at styre, helcelle-strømme har store variationer. Endvidere fordi strøm er lille, vil pålidelige statistikker nødt til at stole på store stikprøvestørrelser, ofte ikke praktisk. Patch-clamp undersøgelser er sjældent blevet udført. Nogle af disse optagelser viser klynger af aktivitet byger, der gør statistisk evaluering udfordrende 16,17.
For bedre at forstå den molekylære mechanosensitivity, har vi udviklet yderligere to systemer til at undersøge TRPV4. (1) For at isolere TRPV4 væk fra sine sædvanlige pattedyr partnere, vi har udtrykt rotte TRPV4 i spirende gær 24. Funktionel udtryk for TRPV4 i denne evolutionært fjernt forbindelse viste, at det stadig kan reagere på osmotisk kraft uden sine sædvanlige samarbejdspartnere. Fordi gær giver ingen PUFA såsom AA eller EET, og dens genom har ingen PLA2 eller epoxygenase gener, dette EXPREssion viser også, at de ikke er påkrævet for TRPV4 at fornemme kraft. Under TRPV4 i de molekylære biologisk mest medgørlige eukaryoter også tillader effektiv frem-eller tilbage-genetiske manipulationer 25. (2) For dybtgående biofysiske analyser af TRPV4 udtrykte vi TRPV4 i Xenopus oocytter. I modsætning til dyrkede celler, der giver sub-Na Na (10 -10 til 10 -9 A) strømme, en oocyt udtrykker strømninger i uA s (10 -6 til 10 -4 A). Meget større signal over støj giver en bedre kvantificering og mere sikker sammenligning. TRPV4, så udtrykte, kan også undersøges som enkelte molekyler ved hjælp af en patch clamp. En enkelt oocyt tillader gentagne patch prøveudtagning, igen gør kvantificering mere pålidelige. Sådanne undersøgelser har vist, at TRPV4 selve kanalen direkte kan aktiveres ved membran stræk kraft 14. Analyser viste også, at 14 repræsentative skelet-dysplasi alleler er alle gain-of-funktion mutationer. Endvidere graderee af denne konstitutive Ca 2 + lækage paralleller sværhedsgraden af skelet sygdomme 23.
På grund af deres nyhedsværdi og nytte er de detaljerede procedurer for disse to metoder er samlet her for at give gentagelser i fremtidige forskning på TRPV4 eller lignende kanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som anført i indledningen, de metoder, der almindeligvis anvendes til at studere TRPV4 funktioner til tider resulteret i uoverensstemmelser og kontroverser. De to sæt af metoder, der beskrives her tilbyde nogle fordele, og kan supplere de eksisterende metoder. Mens vi beskriver kun de undersøgelser om TRPV4 kan de metoder udvides til at studere andre ionkanaler samt.
1.. Gær luminometri Metoder
Spirende gær har en indfødt Ca 2 +-tilstrømning respo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Andrea Kremsreiter for fremragende teknisk bistand. Arbejde i vores laboratorium er støttet af NIH GM096088 og Vilas Trust fra University of Wisconsin – Madison.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
References
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
- Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
- Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
- Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
- Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
- Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
- Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
- Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
- Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
- Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
- Gao, X., Wu, L., O’Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
- Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
- Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
- Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
- Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
- Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
- Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
- Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
- Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
- Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
- Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
- Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
- Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Conn, P. M. . Methods in Enzymology. 294, (1999).
- Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. . Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).
- Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).
