החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ”א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).
במהלך התמיינות תאי נבט האשכים, המבנה של כרומטין גרעיני משתנה באופן דינמי. להלן שיטה שנועדה לשמר את סידור הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים המצויים בעכברים; שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). בשיטה זו, צינוריות האשכים מטופלים ישירות עם שלב חדירה שמסיר חומר ציטופלסמי, ואחריו שלב קיבעון שמתקן חומרים גרעיניים. לאחר מכן, הצינוריות מנותקות, השעיית התא היא ציטוספון, והתאים נצמדים לשקופיות. שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ”א ו- RNA בהכלאה במקום (FISH) והשילוב של שיטות זיהוי אלה. כדוגמה ליישום אפשרי של שיטת השקופית 3D, דג RNA Cot-1 מוצג כדי לזהות RNAs המתהווה. שיטת שקופית 3D תאפשר בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין מבנה כרומטין, DNA, ו RNA במהלך התמיינות תא נבט האשכים.
באשכים, תאי נבט להבדיל זרע דיפלואידית דרך מיוזיס לתוך בוגר, זרע haploid. במהלך תהליך זה, מבנה הכרומטין הגרעיני של תאי נבט הוא שיפץ באופן רציף ודינמי. ממרחי פני השטח משמשים בדרך כלל לבדיקה ציטולוגית של תאי זרע בודדים. שיטה רווחת של התפשטות פני השטח מעסיקה טיפול היפוטוני שבאמצעותו תאים זרע בודדים מופצים ומשוטחים1. תנאים אלה הם אופטימליים לניתוח מפורט של כרומוזומים מיוטיים. תכונות כרומוזומליות כגון מצב סינפטי ומוקדי רקומביניזציה נצפו בקלות בשיטה זו. עם זאת, הטיפול ההיפוטוני משבש את ארכיטקטורת הכרומטין התת-גרעיני, ולכן טכניקה זו אינה מתאימה לניתוח מבני של גרעינים. כתוצאה מכך, שיטה משופרת תוכננה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (3D) (איור 1). שיטת שקופית 3D אפשרה זיהוי של לוקליזציה RNA המתהווה בגרעינים כי זה היה אופטימיזציה בתחילה כדי לבחון ביטוי גנים מצבי כרומטין במהלך התמיינות תא נבט האשכים על ידי פלואורסצנטיות RNA בהכלאה situ (FISH)2,3. שיטה תלת-ממדית זו חלה גם על השילוב של כשל חיסוני, דנ”א ודגי RNA. בנוסף, שיטה זו סייעה בגילוי כרומטין מין פוסט-מיוטי (PMSC), תא שקט של כרומוזומי המין שנמצאו בזרעונים פוסט-מיוטיים2.
שיטת השקופית בתלת-ממד עברה אופטימיזציה במקור באמצעות שילוב של שני שלבים חיוניים של הכנת שקופיות המשמשים בדרך כלל לכתמים גרעיניים: שלב הקיבעון שנועד לתקן חומרים גרעיניים וצעד ההחלחלה שנועד להסיר חומרים ציטופלסמיים על מנת לשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים, כגון נוגדנים ובדיקות FISH. כפי שתואר קודם לכן בפרסום אחר3, נקבע כי שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות עם רקע ציטופלסמי נמוך. בשיטת שקופית תלת-ממדית זו, שלב ההחלחלה ושלב הקיבעון הבאים מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-שנתיות ואחריהן הניתוק המכני של תאי נבט עם מלקחיים לפני ציטוספין על שקופיות. שיטה חלופית עבור דג RNA של תאים spermatogenic פותחה במעבדה אחרת4. בשיטה זו, בהתאם לשיטת 3D, שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות של RNA FISH.
הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת השקופית תלת-ממדית ומספק דוגמה ליישום אפשרי, Cot-1 RNA FISH לגילוי RNAs גרעיניים. דנ”א קוט-1 מורכב מאלמנטים שחוזרים על עצמו בגנום. כאן, גשוש DNA קוט-1 הוא היברידית אינטרון ו UTR של התמלילים המתהווים, ובכך לזהות את האזורים הפעילים שעתוק בגרעין5,6. שקופיות תלת מימד הן רב-תכליתיות וניתן ליישם אותן על שילוב של טכניקות כשל חיסוני, DNA ו- RNA FISH על מנת לקבל בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין ארכיטקטורת הכרומטין.
בהכנת שקופיות תלת-ממדיות, שלב ההחלחלה מקדים את שלב הקיבעון. שלבים אלה מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-חצי, ובכך משמרים את מבנה הכרומטין התלת מימדי. אפשרות חלופית לשימור מבנה הכרומטין עבור RNA / DNA FISH היא לבצע את שלב permeabilization ואת שלב הקיבעון בו זמנית. טכניקה חלופית זו בוצעה בתאי נבט כיס בעוברים ?…
The authors have nothing to disclose.
אני מודה לג’יני טי לי על הפיקוח על הפרויקט הזה כשהייתי במעבדה של לי וטיילר ברורינג על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס בזיל אוקונור סטרטר מלומד מקרן מצעדת דימס ו- NIH Grant GM098605.
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
Forceps | VWR | 300-050 |
Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
Cytospin 3 | Shandon | |
Coplin jar | Fisher | 08-815 |
Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
Cover glass | Fisher | 12-544-G |
Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |