Slide Forberedelse Metode til at bevare tre-dimensionelle Chromatin Arkitektur testikelceller

Summary

Materialet her beskriver en metode udviklet til at bevare den tredimensionelle chromatin struktur testikel kimceller. Dette er blevet kaldt den tredimensionale (3D) diasmetode. Denne metode forbedrer følsomheden for påvisning af subnukleare strukturer og gælder for immunfluorescens, DNA og RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH).

Abstract

Under testikelkimcelledifferentiering ændres strukturen af nuklear kromatin dynamisk. I det følgende beskrives en metode, der er udformet med henblik på at bevare det tredimensionale chromatinarrangement af testikelkimceller, der findes hos mus; Denne metode er blevet kaldt den tredimensionale (3D) diasmetode. I denne metode behandles testikelrør direkte med et gennemtrængningstrin, der fjerner cytoplasmisk materiale, efterfulgt af et fikseringstrin, der løser nukleare materialer. Tubules adskilles derefter, celleaffjedringen er cytospun, og celler klæber til dias. Denne metode forbedrer følsomheden over for påvisning af subnukleare strukturer og gælder for immunfluorescens, DNA og RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) og kombinationen af disse detektionsmetoder. Som et eksempel på en mulig anvendelse af 3D-diasmetoden vises en Cot-1 RNA FISH til at registrere spirende RNA’er. 3D-slidemetoden vil lette den detaljerede undersøgelse af rumlige relationer mellem kromatinstruktur, DNA og RNA under testikelkimcelledifferentiering.

Introduction

I testikler differentierer kimceller fra diploid spermatogonia gennem meiose til moden, haploid spermatozoa. Under denne proces omformes den nukleare chromatinstruktur af kimceller kontinuerligt og dynamisk. Overfladespredninger er almindeligt anvendt til cytologisk undersøgelse af individuelle spermatogene celler. En fremherskende metode til overfladespredning anvender hypotonisk behandling, hvorved individuelle spermatogene celler spredes og flades¹. Disse betingelser er optimale til detaljeret analyse af meiotiske kromosomer. Kromosomale træk såsom synaptisk status og rekombination foci observeres let ved hjælp af denne metode. Den hypotoniske behandling forstyrrer imidlertid subnuklear kromatinarkitektur, således at denne teknik ikke er egnet til strukturel analyse af kerner. Derfor er en forbedret metode designet til at bevare den tredimensionelle chromatinstruktur af testikelkimceller. Denne metode er blevet kaldt den tredimensionale (3D) diasmetode (Figur 1). 3D-diasmetoden har gjort det muligt at detektere spirende RNA-lokalisering i kerner, fordi den oprindeligt blev optimeret til at undersøge genekspression og kromatinestater under testikelkimcelledifferentiering ved RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)^2,3. Denne 3D-metode gælder også for kombinationen af immunfluorescens, DNA og RNA FISH. Derudover har denne metode hjulpet med opdagelsen af postmeiotisk sexkromati (PMSC), et stille rum af kønskromosomerne, der findes i postmeiotiske spermatids².

3D-diasmetoden blev oprindeligt optimeret gennem kombinationen af to væsentlige trin i diaspræparatet, der almindeligvis anvendes til nuklear farvning: fikseringstrinet designet til at fastsætte nukleare materialer og gennemtrængningstrinnet, der har til formål at fjerne cytoplasmiske materialer for at forbedre tilgængeligheden af farvningsreagenser, såsom antistoffer og FISH-sonder. Som tidligere beskrevet i en anden^{publikation 3}er det blevet fastslået, at gennemtrængningstrinnet skal gå forud for fikseringstrinnet for at opnå optimale resultater med lav cytoplasmisk baggrund. I denne 3D-diasmetode udføres gennemtrængningstrinnet og det efterfølgende fikseringstrin direkte på seminiferøse tubules og efterfølges af mekanisk dissociation af kimceller med pincet, før de cytospines på dias. En alternativ metode til RNA FISH af spermatogene celler blev udviklet i et andet laboratorium⁴. I denne metode, der er i overensstemmelse med 3D-metoden, skal gennemtrængningstrinnet gå forud for fikseringstrinnet for at opnå optimale resultater af RNA FISH.

Følgende protokol beskriver 3D-diasmetoden og giver et eksempel på en mulig applikation, Cot-1 RNA FISH til påvisning af nukleare spirende RNA’er. Cot-1 DNA består af gentagne elementer i genomet. Her hybridiseres en Cot-1 DNA-sonde til en intron og UTR af de spirende udskrifter og registrerer derved de transskriptionsmæssigt aktive regioner i kerne^5,6. 3D-dias er alsidige og kan anvendes på en kombination af immunfluorescens, DNA og RNA FISH teknikker med henblik på at opnå en detaljeret undersøgelse af rumlige relationer mellem chromatin arkitektur.

Protocol

1.3D Forberedelse af dias Forbered følgende reagenser: CSK buffer: 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 10 mM RØR, 3 mM MgCl2. Juster pH til 6,8 med 1 M NaOH. CSK-bufferen opbevares ved 4 °C. CSK buffer med 0,5% Triton X-100: Tilsæt 200 μl Triton X-100 til 40 ml CSK buffer. Opløsningen blandes med magnetisk omrører, indtil Triton X-100 er helt opløst. CSK-bufferen opbevares med 0,5% Triton X-100 ved 4 °C. 4% Paraformaldehyd (PFA)-PBS, pH 7,4: 4 g PFA opløses i ca. 7…

Representative Results

Et repræsentativt resultat af et 3D-dias vises i figur 2. I dette eksperiment blev Cot-1 RNA FISH udført for at detektere spirende transskription sammen med immunostaining ved hjælp af anti CBX1 og γH2AX antistoffer. For at kombinere RNA FISH og immunostaining blev immunostaining udført først, efterfulgt af RNA FISH som beskrevet i3. CBX1 er et heterochromatinprotein, der lokaliserer sig til pericentromerisk heterochromatin og tavse kønskromosomer i meiose kaldet en XY-krop (eller sexkr…

Discussion

I 3D-diasforberedelse går gennemstrængningstrinnet forud for fikseringstrinnet. Disse trin udføres direkte på seminiferous tubules og derved bevarer den tredimensionelle chromatinstruktur. En alternativ mulighed for at bevare chromatin struktur for RNA / DNA FISH er at udføre permeabilization trin og fiksering trin samtidigt. Denne alternative teknik er blevet udført i pungdyr kimceller og i mus præimplantation embryoner^7,8. Men hvis fikseringstrinnet går forud for gennemtrængningstrinnet, kan det giv…

Materials

Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit	Agilent	300380
Herring sperm DNA Solution	Invitrogen	15634-017
Ethanol, 200 proof (absolute)	Pharmco-AAPER	111000200
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide deionized	American Bioanalytical	AB00600-00500
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma-Aldrich	C8532
Bovine serum albumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	76240
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Columns	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Forceps	VWR	300-050
Microcentrifuge tubes	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
4-well dish	Fisher	12-566-301
Cover glass	Fisher	12-544-G
Air incubator	Revolutionary Science	RS-IF-203