Bildberedningsmetod för att bevara tredimensionell kromatinarkitektur av testikelceller

Summary

Materialet beskriver här en metod som utvecklats för att bevara den tredimensionella kromatinstrukturen hos testikelceller. Detta har kallats den tredimensionella (3D) bildmetoden. Denna metod förbättrar känsligheten för detektion av subnukleära strukturer och är tillämplig för immunofluorescens, DNA och RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH).

Abstract

Under testikel könsceller differentiering förändras strukturen av nukleära kromatin dynamiskt. Nedan beskrivs en metod som är utformad för att bevara det tredimensionella kromatinarrangemanget av testikelceller som finns hos möss. Denna metod har kallats den tredimensionella (3D) bildmetoden. I denna metod behandlas testikelrör direkt med ett permeabiliseringssteg som tar bort cytoplasmiskt material, följt av ett fixeringssteg som fixerar kärnmaterial. Tubuler demonteras sedan, cellupphängningen är cytospun och cellerna klibbar vid diabilder. Denna metod förbättrar känsligheten för detektion av subnukleära strukturer och är tillämplig för immunofluorescens, DNA och RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) och kombinationen av dessa detektionsmetoder. Som ett exempel på en möjlig tillämpning av 3D-glidmetoden visas en Cot-1 RNA FISH för att upptäcka gryende RNAs. 3D-glidmetoden kommer att underlätta detaljerad undersökning av rumsliga relationer mellan kromatinstruktur, DNA och RNA under testikelreceller differentiering.

Introduction

I testilysatorer skiljer sig könsceller från diploid spermatogonia genom meios till mogna, haploid spermatozoa. Under denna process ombyggnads den nukleära kromatinstrukturen hos könsceller kontinuerligt och dynamiskt. Ytspridningar används ofta för cytologisk undersökning av enskilda spermatogena celler. En rådande metod för ytspridning använder hypoton behandling genom vilken enskilda spermatogena celler sprids och plattas^{ut 1}. Dessa villkor är optimala för detaljerad analys av meiotiska kromosomer. Kromosomala funktioner som synaptisk status och rekombinationsfoci observeras lätt med denna metod. Hypotona behandlingen stör dock subnukleära chromatin arkitektur, således denna teknik är inte lämplig för strukturell analys av atomkärnor. Följaktligen har en förbättrad metod utformats för att bevara den tredimensionella kromatinstrukturen hos testikelceller. Denna metod har kallats den tredimensionella (3D) bildmetoden (figur 1). 3D-glidmetoden har gjort det möjligt att upptäcka gryende RNA-lokalisering i atomkärnor eftersom den ursprungligen optimerades för att undersöka genuttryck och kromatin tillstånd under testikel könsceller differentiering av RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH)^2,3. Denna 3D-metod är också tillämplig på kombinationen av immunofluorescens, DNA och RNA FISH. Dessutom har denna metod hjälpt till att upptäcka postmeiotisk könskromatin (PMSC), ett tyst fack av könskromosomerna som finns i postmeiotiska spermatider².

3D-glidmetoden optimerades ursprungligen genom kombinationen av två viktiga steg för glidberedning som vanligtvis används för kärnfärgning: fixeringssteget som utformats för att fixa kärnmaterial och permeabiliseringssteget avsett att ta bort cytoplasmaiska material för att förbättra tillgängligheten för färgreagenser, såsom antikroppar och FISK-sonder. Som tidigare beskrivits i en^{annan publikation 3}har det fastställts att permeabiliseringssteget måste föregå fixeringssteget för att uppnå optimala resultat med låg cytoplasmisk bakgrund. I denna 3D-glidmetod utförs permeabiliseringssteget och efterföljande fixeringssteg direkt på seminiferous tubules och följs av mekanisk dissociation av könsceller med tång före cytospinning på diabilder. En alternativ metod för RNA FISH av spermatogenic celler utvecklades i ett annat laboratorium⁴. I denna metod, i överensstämmelse med 3D-metoden, måste permeabiliseringssteget föregå fixeringssteget för att uppnå optimala resultat av RNA FISH.

Följande protokoll beskriver 3D-bildmetoden och ger ett exempel på en möjlig tillämpning, Cot-1 RNA FISH för detektion av nukleära gryende RNAs. Cot-1 DNA består av repetitiva element i genomet. Här hybridiseras en Cot-1 DNA-sond till en intron och UTR av de gryende transkriptionerna, vilket detekterar de transkriptionellt aktiva regionerna i kärnan^5,6. 3D-bilder är mångsidiga och kan appliceras på en kombination av immunofluorescens-, DNA- och RNA FISH-tekniker för att få detaljerad undersökning av rumsliga relationer mellan kromatinarkitektur.

Protocol

1.3D Bildförberedelse Förbered följande reagenser: CSK-buffert: 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 10 mM rör, 3 mM MgCl2. Justera pH till 6,8 med 1 M NaOH. Förvara CSK-bufferten vid 4 °C. CSK-buffert med 0,5% Triton X-100: Tillsätt 200 μl Triton X-100 till 40 ml CSK-buffert. Blanda lösningen med magnetomrörare tills Triton X-100 är helt upplöst. Förvara CSK-bufferten med 0,5% Triton X-100 vid 4 °C. 4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7.4: Lös upp 4 g PFA i cirka…

Representative Results

Ett representativt resultat av en 3D-bild visas i figur 2. I detta experiment utfördes Cot-1 RNA FISH för att upptäcka gryende transkription tillsammans med immunostaining med anti CBX1 och γH2AX antikroppar. För att kombinera RNA FISH och immunostaining utfördes immunostaining först, följt av RNA FISH som beskrivs i3. CBX1 är ett heterokromatinprotein som lokaliserar till pericentromeric heterochromatin och tysta könskromosomer i meios som kallas en XY-kropp (eller sexkropp). γH2AX…

Discussion

I 3D-bildförberedelser föregår permeabiliseringssteget fixeringssteget. Dessa steg utförs direkt på seminiferous tubules, vilket bevarar den tredimensionella kromatinstrukturen. Ett alternativt alternativ till att bevara kromatinstrukturen för RNA/DNA FISH är att utföra permeabiliseringssteget och fixeringssteget samtidigt. Denna alternativa teknik har utförts i pungbakterier och i musförimplantationsembryon^7,8. Men om fixeringssteget föregår permeabiliseringssteget kan det ge upphov till hög cyto…

Materials

Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit	Agilent	300380
Herring sperm DNA Solution	Invitrogen	15634-017
Ethanol, 200 proof (absolute)	Pharmco-AAPER	111000200
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide deionized	American Bioanalytical	AB00600-00500
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma-Aldrich	C8532
Bovine serum albumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	76240
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Columns	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Forceps	VWR	300-050
Microcentrifuge tubes	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
4-well dish	Fisher	12-566-301
Cover glass	Fisher	12-544-G
Air incubator	Revolutionary Science	RS-IF-203