Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Resumo

Nos últimos 15 anos, os vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) provaram sua eficiência na transdução de células in vitro e in vivo e são amplamente utilizados para vacinação e terapia gênica. Aqui, descrevemos um procedimento para construir, produzir e purificar vetores CAV2, dando origem a suspensões virais de alto título.

Resumo

Os vetores derivados de adenovírus (Ad) têm sido amplamente utilizados para transferência de genes de curto ou longo prazo, tanto para terapia gênica quanto para aplicações de vacinas. Devido à frequente imunidade pré-existente contra o adenovírus humano tipo 5 classicamente usado, o adenovírus canino tipo 2 (CAV2) foi proposto como um vetor alternativo para a transferência de genes humanos. A biologia bem caracterizada do CAV2, juntamente com sua facilidade de manipulação genética, oferece grandes vantagens, notadamente para a transferência de genes para o sistema nervoso central, ou para induzir uma ampla gama de respostas imunes protetoras, desde a imunidade humoral até a celular. Atualmente, o CAV2 representa um dos adenovírus não humanos mais atraentes para uso como vetor vacinal. Este protocolo descreve um método simples para construir, produzir e titular vetores CAV2 recombinantes. Após a clonagem do de expressão do gene de interesse em um plasmídeo de transporte, o plasmídeo genômico recombinante é obtido por recombinação homóloga na cepa bacteriana E. coli BJ5183. O plasmídeo genômico resultante é então transfectado em células renais caninas que expressam os genes CAV2-E1 complementares (DK-E1). Uma amplificação viral permite a produção de um grande estoque viral, que é purificado por ultracentrifugação através de gradientes de cloreto de césio e dessalinizado por diálise. A suspensão viral resultante rotineiramente tem um título de mais de 10^{a 10} partículas infecciosas por ml e pode ser administrada diretamente in vivo.

Introdução

Nas últimas décadas, os vetores derivados de adenovírus (Ads) provaram sua eficácia para terapia gênica e vacinação, bem como na viroterapia oncolítica ¹. Os anúncios são vírus icosaédricos não envelopados da família Adenoviridae, que foram isolados de mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Desde sua descoberta em 1953, os ADs têm sido intensamente estudados como modelos para estudar as interações vírus/célula e, mais recentemente, como sistemas de entrega de genes baseados em vetores ². De fato, os vetores baseados em anúncios oferecem muitas vantagens, como sua ampla gama de hospedeiros e biologia bem caracterizada, juntamente co....

Protocolo

1. Construção de um plasmídeo do genoma CAV2 não replicativo

Nota: todos os plasmídeos descritos neste protocolo foram descritos anteriormente⁷ e estão disponíveis mediante solicitação.

1. Clonar o GOI no plasmídeo pShuttle, utilizando enzimas de restrição adequadas, para gerar o pShuttle-GOI (figura 1A).
2. Digerir 2 μg de pShuttle-GOI por AscI/PacI. A digestão libera o fragmento Shuttle-GOI (~ 2,9 kbp + sequência GOI ORF) da estrutura do plasmídeo (2,8 kbp).
3. Purifique o fragmento Shuttle-GOI após eletroforese em gel de agarose, usando o Nucleo....

Resultados

A produção de vetores recombinantes de CAV2 depende de técnicas básicas, mas importantes, de biologia molecular. Antes da produção dos vetores virais, é de fato necessário construir um genoma recombinante de CAV2 contendo um cassete de expressão para o transgene. Essa construção envolve duas etapas: primeiro, o gene de interesse (GOI) é clonado em um plasmídeo intermediário como um cassete de expressão (ou seja, com promotor e sinal de poliadenilação). Esse elemento funcional é flanqueado por duas sequências gen.......

Discussão

O método simples aqui descrito, adaptado da bem documentada tecnologia Ad5, permite a produção eficiente de vetores CAV2 não replicativos com uma capacidade de clonagem típica de ~ 4,2 kbp. Em relação às considerações de tempo, um genoma CAV2 recombinante geralmente é gerado em duas semanas, enquanto levará mais 5 semanas para amplificar, purificar e titular suspensões virais.

Embora a produção do primeiro lote de vetores derivados de CAV2 possa parecer demorada, deve-se lembrar que a produção.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Enzimas de restrição	New England Biolabs	Vários
Jet Prime kit de transfecção	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli BJ5183 bactérias	Agilent	200154
PD-10 coluna de dessalinização	GE Healthcare	17-0851-01
Nucleospin EmeraldAmp polimerase	Takara	RR320A
	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
Tubos de 14 ml, Ultra Clear	Beckman	344060

Kit de plasmídeo