Vi beskriver brugen af de monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 til kombineret påvisning af celleoverfladeantigener via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til identifikation og berigelse af levende menneskelige embryonale stamceller (hESC) ved hjælp af positiv udvælgelse og også brugen af negativ udvælgelse til at rense HESC’er fra en blandet cellepopulation.
Humane embryonale stamceller (hESC) kan forny sig selv på ubestemt tid in vitro, og med de relevante signaler kan induceres til at differentiere i potentielt alle somatiske celle afstamninger. Differentierede hESC-derivater kan potentielt anvendes i transplantationsbehandlinger til behandling af en række celledegenerative sygdomme. HESC-differentieringsprotokoller giver dog normalt en blanding af differentierede mål- og off-target celletyper samt resterende udifferentierede celler. Til oversættelse af differentierede hESC-derivater fra laboratoriet til klinikken er det vigtigt at kunne skelne mellem udifferentierede (pluripotente) og differentierede celler og generere metoder til at adskille disse populationer. Sikker anvendelse af hESC-afledte somatiske celletyper kan kun opnås med pluripotente stamcellefri populationer, da resterende HESC’er kan fremkalde tumorer kendt som teratomer efter transplantation. Med henblik herpå beskriver vi her en metode til påvisning af pluripotensrelaterede celleoverfladeantigener med de monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til identifikation af pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs ved hjælp af positiv udvælgelse. Ved hjælp af negativ udvælgelse med vores TG30/GCTM-2 FACS-metode var vi i stand til at opdage og rense udifferentierede HESC’er i populationer, der gennemgår meget tidlig differentiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). I en yderligere undersøgelse, pluripotente stamcelle-fri prøver af differentierede TG30 Neg-GCTM-2Neg celler udvalgt ved hjælp af vores TG30/GCTM-2 FACS protokol ikke danne teratomer gang transplanteret i immun-kompromitteret mus, støtte robusthed af vores protokol. På den anden side påvirkede TG30/GCTM-2 FACS-medieret på hinanden følgende passaging af beriget pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESC’er ikke deres evne til selvfornyelse in vitro eller deres iboende pluripotency. Derfor giver kendetegnene ved vores TG30/GCTM-2 FACS-metode en følsom analyse for at opnå højt berigede populationer af hPSC som input til differentieringsanalyser og for at fjerne potentielt tumorigenic (eller resterende) hESC fra afledte cellepopulationer.
HPSC (hPSC) omfatter humane embryonale stamceller (hESC) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hIPSC). HPSC kan forny sig selv på ubestemt tid under passende kulturforhold uden at miste deres evner kendt som “pluripotency”. Pluripotens defineres som potentialet for en celle til at differentiere i det væsentlige enhver somatisk celle afstamning, herunder celler repræsentative for hver af de tre embryonale kimcelle lag. Det bemærkelsesværdige potentiale i hPSC giver et middel til en lang række cellebaserede applikationer, herunder terapeutiske muligheder. For eksempel er der lidelser, der involverer celledød og degeneration, hvor normal funktionalitet af celler i menneskekroppen er kompromitteret, som i hjertesvigt, rygskader, diabetes, Parkinsons sygdom, nogle kræftformer og andre kliniske patologier. Patienter, der lider af disse tilstande, kan potentielt behandles ved at transplantere sunde og funktionelle somatiske celler, der er afledt af hPSC i laboratoriet. De nuværende hPSC-differentieringsprotokoller er imidlertid ikke 100% effektive og giver en blanding af differentierede mål- og off-target celletyper samt resterende hPSC’er, der ikke har gennemgået differentiering, i stedet fortsætter med at fornyselv 1-3. Tilstedeværelsen af selv et lille antal hPSC i en prøve af hPSC-afledte somatiske celler beregnet til transplantation til patienter udgør en alvorlig klinisk risiko, da disse celler ved deres iboende natur til at danne væv af alle tre embryonale kimlag, potentielt kunne danne in vivo en type tumor kendt som en teratoma. Derfor kan kun målcellepopulationer, der er bestemt til at være fri for pluripotente stamceller, betragtes som sikre til transplantation til patienter. Der er flere metoder rapporteret til potentielt at opnå udrensning af resterende HPSCs efter differentiering, (til gennemgang se Polanco og Laslett4). Vi har tidligere rapporteret brugen af de monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 koblet til fluorescens aktiveret cellesortering (FACS) for at identificere pluripotente stamceller og diskriminere dem fra celler, der gennemgår tidlig differentiering i kulturer afhESC-linjer 5-7.
En fordel ved at bruge antistoffer til at detektere celleoverfladeantigener er, at målcellerne normalt er levedygtige efter antistofbinding og/eller mærkning. Derfor kan målceller indsamles efter antistofmærkning og rekultureres til ekspansion og yderligere applikationer før transplantation. En advarsel for celleoverfladeantigener udtrykt på hPSC er, at de ikke er eksklusive i pluripotente fase og i mange tilfælde udtrykkes tidsmæssigt igen under udviklingen og derfor vil blive opdaget i nogle differentierede celletyper. Hvis målet er at anvende antistoffer til at detektere humane pluripotente celler og rense dem fra en prøve af hPSC-afledte celler, bør udvalgte antistoffer derfor ikke også reagere med antigener på de specifikke differentierede celletyper, der er beregnet til transplantation. Desværre er der et begrænset antal antistoffer, der registrerer celleoverflademarkører på live hPSCs 4, hvilket gør begrænsede muligheder for valg. Derudover har nogle få undersøgelser påpeget, at påvisning af en enkelt celleoverflademarkør ikke er tilstrækkelig til at eliminere alle hPSC, hvilket tyder på, at ethvert forsøg på at eliminere alle hPSC pluripotente delpopulationer bør baseres på metoder, der bruger to eller flere antistoffer, der registrerer forskellige epitoper udtrykt af hPSC 9-10. Som nævnt ovenfor er det kun hPSC-afledte celler, der kan bestemmes som pluripotente stamcellefri cellepopulationer, der er egnede til menneskelig transplantation. At nå dette strenghedsniveau opnås muligvis ikke med et enkelt gennemløb gennem en antistofmedieret cellesorteringsteknologi. Rekultur af den berigede population af differentierede målceller og efterfølgende runder af cellesortering kan være påkrævet for definitivt at opnå pluripotente stamcellefri prøver.
I vores laboratorium har vi udførligt karakteriseret to hES celle-overflade antistoffer, TG30 (CD9) og GCTM-2, til påvisning af levende pluripotente celler. Vores undersøgelser har vist, at kombineret detektion af både TG30 og GCTM-2 stærkt korrelerer med udtrykket af kanoniske pluripotency-associerede gener i hESC-linjer 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling har konsekvent vist, at hESC kulturer udgør en kvantitativ kontinuerlig gradient af TG30/GCTM-2 udtryk 5-7. Vi har vilkårligt etableret fire populationer (P) af celler inden for denne TG30/GCTM-2 gradient: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG3 0Lav-GCTM-2Lav),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Vores karakteristik af disse P4, P5, P6 og P7 cellepopulationer har vist, at P6 og P7 subfractions udtrykke et stort antal pluripotens-associerede gener og effektivt danne stamcellelignende kolonier, når rekultureret post-FACS 2-3. På den anden side udtrykker P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)et stort antal differentieringsmarkører og udgør de spontant differentierede celletyper, der typisk forekommer i ekspanderende kulturer af hESC-linjer 5-6. Vi besluttede at teste potentialet i vores TG30/GCTM-2 FACS for selektiv eliminering af resterende HPSCs efter tidlig differentiering, og også til berigelse af pluripotente stamcellepopulationer. Protokollen beskrevet nedenfor viser, hvordan man indsamler og rekultur differentieret P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler post-FACS at opnå udrensning af pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Desuden forklarer vi også indsamling og rekultur af pluripotente P7 -celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)for at opnå en beriget kultur af pluripotente celler, som efterfølgende kan bruges som en defineret inputpopulation for potentielt at øge effektiviteten og konsistensen af differentieringsanalyser.
I den kliniske sammenhæng er differentierede somatiske celletyper det endelige ønskede produkt til transplantation og terapeutiske anvendelser, og hPSC er en selvfornyende og skalerbar kilde til at generere disse somatiske celler eller deres forfædre i laboratoriet. Tilstedeværelsen af resterende udifferentierede hESC’er med et iboende potentiale for teratomadannelse er en sikkerhedsrisiko, når man overvejer hESC-afledte somatiske celler til transplantation til patienter. For en gennemgang af dette og andre risici forbundet med celleterapi se Sharpe et al. 16 For at realisere sådanne anvendelser er det derfor bydende nødvendigt, at forskere sigter mod at generere målcellepopulationer, der også er pluripotente stamcellefri. I den forbindelse demonstrerer vi her, at det ved hjælp af vores TG30/GCTM-2 FACS-metode er muligt at overvåge for tilstedeværelsen af pluripotente celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) i en differentierende cellepopulation og opnå levedygtige hESC-differentierede derivater, der kan beriges og rekultureres efter FACS. Selv om det ikke er muligt at opnå 100% pluripotente stamcellefri prøver med et enkelt gennemløb af vores protokol, kan berigede hESC-derivater rekultureres, og efter fortløbende passaging opnås 100% somatisk cellerenhed. Den påviste levedygtighed af somatiske celler til ekspansion efter FACS giver også potentielt mulighed for produktion af et tilstrækkeligt antal celler, der er egnede til potentielle transplantationsbehandlinger.
De opmuntrende resultater af denne pilotundersøgelse fik os til at udføre en mere omfattende undersøgelse ved hjælp af vores TG30/GCTM-2-protokol i en sammenlignende undersøgelse med flere menneskeskabte pluripotente stamcellelinjer (hiPSC)linje 15. I denne undersøgelse fandt vi, at pluripotente stamcellefri prøver opnået ved hjælp af vores TG30/GCTM-2 FACS-protokol ikke genererede teratomer, når de blev transplanteret til immunfattige mus. Derfor kan vi trygt sige, at med brugen af denne in vitro-protokol udvikler tidlige differentieringscellekulturer, der er bestemt til at være fri for pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi-celler, ikke teratomer in vivo. Dette understøtter kraftigt robustheden af vores analyse, hvilket giver en potentiel tilgang til at eliminere risikoen for teratomadannelse før brug af hPSC-afledte celler i kliniske applikationer.
Omvendt viser vi også, at TG30/GCTM-2 FACS assay kan bruges til at hente en pluripotent cellepopulation med højt niveau af udtryk for disse to overfladeantigener (TG30Hi-GCTM-2Hi). Tidligere undersøgelser har vist, at TG30Hi-GCTM-2Hi celler udviser den højeste korrelation med OCT4hi udtryk og danner det højeste antal hESC-lignende kolonier5,6,13,15. Vi er derfor ræsonnerede for, at pluripotencynetværket aktiveres på dets maksimale niveauer i TG30Hi-GCTM-2Hi, der udtrykker celler. Vi mener, at brugen af vores TG30/GCTM-2 FACS-protokol og hentning af P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)kan give mulighed for storstilet rensning af berigede levende hESC-kulturer, som input til differentieringsanalyser.
Afslutningsvis demonstrerer vi her potentialiteten i vores FACS-analyse baseret på det kombinerede udtryk for overfladeantigener TG30 og GCTM-2 til både udrensning og berigelse af hESC’er. Fremtidige undersøgelser med protokoller for direkte differentiering af HPSC’er vil sandsynligvis også være informative med hensyn til denne potentielle potentialitet. Vi er klar over, at i nogle assays, hvor differentierede hESC-derivater tidsmæssigt udtrykke TG30 (CD9) eller GCTM-2, disse to antistoffer måske ikke være hensigtsmæssigt eller tilstrækkeligt til at rense pluripotente celler fra en differentieret befolkning på et bestemt tidspunkt i analysen6. Derfor er der et vedvarende behov for at finde nye antistoffer, der specifikt genkender levende HESC’er for at overvinde den mulige begrænsning af krydsreaktion med nogle differentierede celletyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker StemCore-anlægget på Monash University for levering af hESC-linjer og FlowCore-anlægget på Monash University for FACS-tjenester. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra den australske Stem Cell Centre, New South Wales og victorianske regering Stem Cell Research Grant Program til alle. ALL er partner investigator for Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative i Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
Table 4. List of materials and reagent | |||
[header] | |||
FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Table 5. List of equipment. |