Vi beskriver användningen av monoklonala antikroppar TG30 (CD9) och GCTM-2 för kombinerad detektion av cell ytan antigener via fluorescens aktiverade cell sortering (FACS) för identifiering och berikning av levande mänskliga embryonala stamceller (hESC) med hjälp av positivt urval och även användning av negativa urval för att rensa hESCs från en blandad cell population.
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) kan självförnya på obestämd tid in vitro, och med lämpliga signaler kan induceras att differentiera till potentiellt alla somatiska celstammar. Differentierade hESC derivat kan potentiellt användas i transplantation terapier för att behandla en mängd olika cell-degenerativa sjukdomar. HESC-differentieringsprotokoll ger dock vanligtvis en blandning av differentierade mål- och off-target-celltyper samt återstående odifferentierade celler. För översättning av differentierade hESC-derivat från laboratoriet till kliniken är det viktigt att kunna skilja mellan odifferentierade (pluripotenta) och differentierade celler och generera metoder för att separera dessa populationer. Säker tillämpning av hESC-härledda somatiska celltyper kan endast uppnås med pluripotenta stamcellsfria populationer, eftersom resterande hESCs kan inducera tumörer som kallas teratomas efter transplantation. Mot denna ände beskriver vi här en metodik för att upptäcka pluripotens associerade cell ytan antigener med monoklonala antikroppar TG30 (CD9) och GCTM-2 via fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) för identifiering av pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs med hjälp av positivt urval. Med hjälp av negativt urval med vår TG30/ GCTM-2 FACS-metodik kunde vi upptäcka och rensa odifferentierade hESCs i populationer som genomgår mycket tidig differentiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). I en ytterligare studie, pluripotenta stamcellsfria prover av differentierade TG30Neg-GCTM-2Neg celler valda med hjälp av vår TG30/GCTM-2 FACS protokoll inte bilda teratomas en gång transplanteras till immun-komprometterade möss, stödja robustheten i vårt protokoll. Å andra sidan påverkade TG30/GCTM-2 FACS-medierad på varandra följande passande TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs inte deras förmåga att förnya sig själv in vitro eller deras inneboende pluripotens. Egenskaperna hos vår TG30/GCTM-2 FACS-metod ger därför en känslig analys för att erhålla mycket berikade populationer av hPSC som indata för differentieringsanalyser och för att befria potentiellt tumörogena (eller kvarvarande) hESC från derivatcellpopulationer.
HPSC (hPSC) omfattar mänskliga embryonala stamceller (hESC) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hIPSC). HPSC kan självförnya på obestämd tid under lämpliga kulturförhållanden utan att förlora sin förmåga som kallas “pluripotency”. Pluripotens definieras som potentialen för en cell att differentiera till i huvudsak somatisk cell härstamning inklusive celler som är representativa för var och en av de tre embryonala könscellerna lager. Den anmärkningsvärda potentialen hos hPSC ger ett sätt för ett stort antal cellbaserade applikationer inklusive terapeutiska alternativ. Till exempel finns det störningar som involverar celldöd och degeneration, där normal funktionalitet hos celler i människokroppen äventyras, som vid hjärtsvikt, ryggmärgsskador, diabetes, Parkinsons sjukdom, vissa cancerformer och andra kliniska patologier. Patienter som lider av dessa tillstånd kan potentiellt behandlas genom transplantation av friska och funktionella somatiska celler som har härletts från hPSC i laboratoriet. De nuvarande hPSC-differentieringsprotokollen är dock inte 100% effektiva och ger en blandning av differentierade mål- och off-target-celltyper, liksom kvarvarande hPSCs som inte har genomgått differentiering, istället fortsätter att självförnya1-3. Förekomsten av även ett litet antal hPSC i ett urval av hPSC-härledda somatiska celler avsedda för transplantation till patienter utgör en allvarlig klinisk risk eftersom dessa celler av sin inneboende natur att bilda vävnader av alla tre embryonala könsceller lager, potentiellt kan bilda in vivo en typ av tumör som kallas teratom. Därför kan endast målcellspopulationer som är fast beslutna att vara fria från pluripotenta stamceller anses vara säkra för transplantation till patienter. Det finns flera metoder som rapporteras för att potentiellt åstadkomma rensning av kvarvarande hPSCs efter differentiering, (för granskning se Polanco och Laslett4). Vi har tidigare rapporterat användningen av monoklonala antikropparna TG30 (CD9) och GCTM-2 kopplade till fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att identifiera pluripotenta stamceller och diskriminera dem från celler som genomgår tidigt differentieringsstadium i kulturer av hESClinjer 5-7.
En fördel med att använda antikroppar för att upptäcka cellytans antigener är att målcellerna vanligtvis är livskraftiga efter antikroppsbindning och/eller märkning. Därför kan målceller samlas in efter antikroppsmärkning och återkomma för expansion och ytterligare tillämpningar före transplantation. En varning för cellytans antigener uttryckta på hPSC är att de inte är exklusiva för pluripotentstadiet och i många fall återutförs tidsmässigt under utvecklingen och kommer därför att upptäckas i vissa differentierade celltyper. Om syftet är att använda antikroppar för att upptäcka mänskliga pluripotenta celler och rensa dem från ett prov av hPSC- härledda celler, bör därför utvalda antikroppar inte också reagera med antigener på de specifika differentierade celltyperna avsedda för transplantation. Tyvärr finns det ett begränsat antal antikroppar som detekterar cellytans markörer på levande hPSCs 4, vilket gör alternativen för val begränsade. Dessutom har några studier påpekat att detektion av en enda cell-ytmarkör inte är tillräckligt för att eliminera all hPSC, vilket tyder på att alla försök att eliminera alla hPSC pluripotenta subpopulationer bör förlita sig på metoder som använder två eller flera antikroppar som upptäcker olika epitoper uttryckta av hPSCs 9-10. Som nämnts ovan är endast hPSC-härledda celler som kan bestämmas som pluripotenta stamcellsfria cellpopulationer lämpliga för mänsklig transplantation. Att nå denna stränghetsnivå kan inte uppnås med ett enda pass genom en antikroppsmedierad cellsorteringsteknik. Rekultur av den berikade populationen av differentierade målceller och efterföljande omgångar av cellsortering kan krävas för att slutgiltigt erhålla pluripotenta stamcellsfria prover.
I vårt laboratorium har vi i stor utsträckning karakteriserat två hES cell-ytan antikroppar, TG30 (CD9) och GCTM-2, för påvisande av levande pluripotenta celler. Våra studier har visat att kombinerad detektion av både TG30 och GCTM-2 starkt korrelerar med uttrycket av kanoniska pluripotency-associerade gener i hESC linjer 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling har konsekvent visat att hESC kulturer utgör en kvantitativ kontinuerlig lutning av TG30/GCTM-2 uttryck 5-7. Vi har godtyckligt etablerat fyra populationer (P) av celler inom denna TG30 / GCTM-2 lutning: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) och P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Vår karakterisering av dessa P4-, P5-, P6- och P7-cellpopulationer har visat att P6- och P7-subfraktionerna uttrycker ett stort antal pluripotensrelaterade gener och effektivt bildar stamliknande kolonier när de återkom efter FACS 2-3. Å andra sidan uttrycker P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)ett stort antal differentieringsmarkörer och utgör de spontant differentierade celltyper som vanligtvis förekommer i expanderande kulturer av hESC-linjer 5-6. Vi bestämde oss för att testa potentialiteten hos våra TG30/GCTM-2 FACS för selektiv eliminering av kvarvarande hPSCs efter tidig differentiering, och även för berikning av pluripotenta stamcellspopulationer. Protokollet som beskrivs nedan visar hur man samlar in och återkultur differentierade P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)efter FACS för att utföra rensning av pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Dessutom förklarar vi också insamling och reculture av pluripotenta P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler för att få en berikad kultur av pluripotenta celler, som därefter kan användas som en definierad insatspopulation för att potentiellt öka effektiviteten och konsekvensen hos differentieringsanalyser.
I det kliniska sammanhanget är differentierade somatiska celltyper den slutliga önskade produkten för transplantation och terapeutiska tillämpningar, och hPSC är en självförnyande och skalbar källa för att generera dessa somatiska celler eller deras förfäder i laboratoriet. Förekomsten av resterande odifferentierade hESCs med en inneboende potential för teratoma bildandet är en säkerhetsrisk när man överväger hESC-härledda somatiska celler för transplantation till patienter. För en genomgång av denna och andra risker i samband med cellterapi, se Sharpe et al. 16 För att förverkliga sådana tillämpningar är det därför absolut nödvändigt att forskare strävar efter att generera målcellspopulationer som också är pluripotenta stamcellsfria. Mot denna punkt visar vi här att med hjälp av vår TG30 / GCTM-2 FACS-metodik är det möjligt att övervaka för närvaron av pluripotenta celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) i en differentierande cellpopulation och få livskraftiga hESC-differentierade derivat som kan berikas och återkultureras efter FACS. Även om det inte är möjligt att få 100% pluripotenta stamcellsfria prover med ett enda pass av vårt protokoll, kan berikade hESC-derivat återkultureras och efter på varandra följande passaging uppnås 100% somatisk cell renhet. Den påvisade livskraften hos somatiska celler för expansion efter FACS möjliggör också potentiellt produktion av tillräckligt antal celler som är lämpliga för potentiella transplantationsbehandlingar.
De uppmuntrande resultaten av denna pilotstudie fick oss att utföra en mer omfattande undersökning med hjälp av vårt TG30/GCTM-2-protokoll i en jämförande studie med flera mänskliga inducerade pluripotenta stamcellslinjer (hiPSC)15. I den studien fann vi att pluripotenta stamcellsfria prover som erhållits med hjälp av vårt TG30/ GCTM-2 FACS-protokoll inte genererade teratomas när de transplanterades till immunsvaga möss. Därför kan vi med säkerhet säga att med hjälp av detta in vitro-protokoll utvecklar tidiga differentieringscellkulturer som är fast beslutna att vara fria från pluripotenta TG30Hi-GCTM-2Hi-celler inte teratomas in vivo. Detta stöder starkt robustheten i vår analys, vilket ger en potentiell metod för att eliminera risken för teratoma bildas före användning av hPSC-härledda celler i kliniska applikationer.
Omvänt visar vi också att TG30/ GCTM-2 FACS-analysen kan användas för att hämta en pluripotent cellpopulation med hög uttrycksnivå för dessa två ytantigener (TG30Hi-GCTM-2Hi). Tidigare studier har visat att TG30Hi-GCTM-2Hi celler uppvisar den högsta korrelationen med OCT4hi uttryck och utgör det högsta antalet hESC-liknande kolonier5,6,13,15. Vi resonerar därför att pluripotency nätverket aktiveras på sina maximala nivåer i TG30Hi-GCTM-2Hi uttrycker celler. Vi anser att användning av våra TG30/GCTM-2 FACS-protokoll och hämtning av P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)skulle kunna möjliggöra storskalig rening av berikade levande hESC-kulturer, som indata till differentieringsanalyser.
Sammanfattningsvis visar vi här potentialiteten hos våra FACS-analyser baserat på det kombinerade uttrycket av ytantigener TG30 och GCTM-2 för både rening och berikning av hESCs. Framtida studier med protokoll för riktad differentiering av hPSCs kommer sannolikt också att vara informativa när det gäller denna potential. Vi är medvetna om att i vissa analyser där differentierade hESC-derivat temporalt uttrycker TG30 (CD9) eller GCTM-2, dessa två antikroppar kanske inte är lämpliga eller tillräckliga för att rensa pluripotenta celler från en differentierad population vid en viss tidpunkt i analysen6. Därför finns det ett pågående behov av att hitta nya antikroppar som specifikt känner igen levande hESCs för att övervinna den möjliga begränsningen av korsreaktion med vissa differentierade celltyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar StemCore-anläggningen vid Monash University för tillhandahållandet av hESC-linjer och FlowCore-anläggningen vid Monash University för FACS-tjänster. Detta arbete stöddes av forskningsanslag från Australian Stem Cell Centre, New South Wales och Victorian Government Stem Cell Research Grant Program to ALL. ALL är partnerutredare för Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative in Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
Table 4. List of materials and reagent | |||
[header] | |||
FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Table 5. List of equipment. |