Дистанционное Магнитный Приведение в микрометрической зондов для<em&gt; На месте</em&gt; 3D Mapping бактериальных биопленок физических свойств

Краткое содержание

В данной работе показано оригинальную методологию, основанную на пульте дистанционного приведения в действие магнитных частиц, посеянных в бактериальной биопленки и развитие специализированных магнитных пинцетом для измерения на месте местные механические свойства комплексной жилой материала построен микроорганизмов на границах.

Аннотация

Бактериальной адгезии и роста на интерфейсах привести к образованию трехмерных гетерогенных структур так называемых биопленки. Клетки, живущие в этих структурах скрепляются физических взаимодействий, опосредованных сети внеклеточных полимерных веществ. Бактериальные биопленки влиять на многие виды деятельности человека и понимание их свойств имеет решающее значение для лучшего контроля их развития - сохранение или ликвидация - в зависимости от их отрицательное или положительное исходом. Эта статья описывает новую методологию, направленную для измерения на месте местные физические свойства биопленки, которая была, до сих пор рассматривалось только от макроскопического и однородного материального точки зрения. Эксперимент, описанный здесь включает введение магнитных частиц в растущую биопленки, чтобы отобрать местные зондов, которые могут быть дистанционным управлением, не нарушая структурные свойства биопленки. Выделенные магнитные пинцет были развивприпрыжку приложить определенное усилие на каждой частице, встроенного в биопленки. Установка монтируется на этапе микроскопом, чтобы включить запись покадровой изображений на период частиц потянув. Траектории частиц затем извлекают из тянущего последовательности и местные вязкоэластичные параметры выводятся из каждой кривой частиц смещения, тем самым обеспечивая 3D-пространственное распределение параметров. Получение взглянуть на биопленки механической профиль имеет важное значение с точки инженера зрения для целей контроля биопленки, но и с фундаментальной точки зрения, чтобы уточнить связь между архитектурными свойствами и конкретного биологии этих структур.

Введение

Бактериальные биопленки сообщества бактерий, связанных с биологическими или искусственных поверхностей ^1-3. Они образуют с помощью механизма адгезии роста в сочетании с производством полисахарида богатых внеклеточного матрикса, который защищает и стабилизирует здание ^4,5. Эти биопленки не просто пассивные комплексы клеток, застрявших на поверхности, но организовал и динамические сложные биологические системы. Когда бактерии переключаться с планктонных в биопленки образа жизни, изменения в экспрессии генов и клеточной физиологии наблюдаются, а также повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам и провести иммунную защиту будучи в начале ....

Протокол

1. Бактерии Культура и подготовка Подвеска

1. Выберите только что выращенного колонию из чашки с агаром лизогении бульон (LB), привить его в 5 мл жидкость LB среду, содержащую 100 μ г / мл ампициллина и 7,5 μ г / мл тетрациклина и инкубировать в течение 5 до 6 часов при 37 ° С на встряхивая платформы.
2. Затем добавляют 100 μ л бактериальной культуры в 5 мл минимальной среды (M63B1) с добавлением 0,4% глюкозы и тех же концентраций антибиотика. Инкубируйте этот разбавленный недавно культуры в течение ночи при 37 ° С на качалке платформы.
3. После 16 часов инкубации, добавьте 100 мкл ночной культуры в 5 мл M63B1, 0,4% гл....

Результаты

Типичный анализ даст пространственное распределение вязкоупругих параметров на микрон шкалой на живого биопленки, не нарушая его оригинальное расположение. Типичные результаты приведены на рисунке 7, где значения J ₀ - упругой податливости, - приводятся в зависимости от оси по глубине и по оси у вдоль поперечного размера биопленки. Каждая точка соответствует шарик, который анализ кривой ползучести предоставил J ₀ значение. Данные показали, что местное соблюдение изменяться по глуби.......

Обсуждение

Это магнитная частица посева и потянув эксперимент включен на месте 3D отображения вязкоупругих параметров растущего биопленки в исходное состояние. Этот подход показал механическую неоднородность Е. палочка биопленки вырос здесь и дал ключи, чтобы указать на компоненты биопленки, поддерживающие биопленки физические свойства, сильно предполагая фундаментальную причастность внеклеточного матрикса и точнее степень его сшивки.

Признание механические свойства моделей в бактериа.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Table 1: Реагенты и ячейки
Магнитные частицы Технологии	жизни	14307D	Микрометрические магнитные частицы, 2.8 &; m
диаметр ампициллина (антибиотик)	Sigma-Aldrich	A9518
Тетрациклин (антибиотик)	Sigma-Aldrich	87128
Бактериальный штамм MG1655gfpF	UGB, Институт Пастера, Франция		Производит на своей поверхности F. pili, устойчивый к ампициллину и тетрациклину.
Table 2: Капилляры и трубки
Фильтры для педиатрической перфузии	Prodimed-Plastimed	6932002
полые квадратные капилляры	Композитный металл Scientific	8280-100	Изготовлен из боросиликатного стекла. Квадрат 0,8 мм x 0,8 мм
Трубка силиконовый пероксид	VWR international	228-0512	Диаметр 1 мм
Трубка силиконовый пероксид	VWR international	228-0700	Диаметр 3 мм
Table 3: Биопленка для роста
Лизогения Бульон (LB) раствор	Amresco-VWR	J106-10PK	Стандартная среда, используемая для выращивания бактерий.
Раствор M63B1	Домашний		стандарт минимальная среда, используемая для выращивания бактерий.
Глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270	Используется для изготовления среды M63B1 с 0,4% глюкозы.
Table 4: Электронная
камера EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Контроллер нагревателя	Мировые прецизионные приборы	300354
Функции генератора	Agilent технологии	33210A
Усилитель мощности	Самодельный		Выдает токовый сигнал с амплитудами до 4 А.
Шприцевые насосы	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Магнитный пинцет	Самодельный		Два электромагнитных полюса, каждый из которых изготовлен из медной катушки с 2 120 витками диаметром 0,56 мм Медная проволока и сердечники из магнитного сплава (Supra50-Arcelor Mittal, Франция) квадратной формы по чертежу, показанному на рисунке Рисунок 10. Два ядра установлены на северном полюсе, обращенном к южному полюсу, чтобы генерировать магнитную силу в одном направлении по длине капилляра. Подробные сведения о проводке катушки см. на рисунке Рисунок 11.
Table 5: Оптический
инвертированный микроскоп	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Объектив (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		Это объектив с большим рабочим расстоянием, позволяющий наблюдать биопленку в глубине.
Эпифлуоресцентные фильтры: 1) для зеленой флуоресценции: Exc 480/20 нм; DM 495; Em 510/20  2) для красной флуоресценции: Exc 540/25 нм; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Смещение частиц при приложении силы регистрируется с помощью красного флуоресцентного фильтрующего блока.
Table 6: Анализ изображений
ImageJ	NIH - плагин

для отслеживания частиц