Мембранный потенциал Краска Визуализация вентромедиального Hypothalamus нейроны от взрослых мышей по изучению глюкозы Sensing
Summary
Деятельность отдельных нейронов мышей взрослых возраста можно изучать с помощью диссоциации нейроны от конкретных областях мозга и использованием изображений потенциальную красителя люминесцентные мембраны. По тестирования реакциям на изменения глюкозы, этот метод может быть использован для изучения чувствительности к глюкозе взрослых вентромедиальных нейронов гипоталамуса.
Abstract
Исследования активности нейронов часто выполняются с использованием нейроны от грызунов менее 2-месячного возраста в связи с техническими трудностями, связанными с увеличением соединительной ткани и снижение нейронов жизнеспособность, которые происходят с возрастом. Здесь мы описываем методологию для диссоциации здоровых нейронов гипоталамуса мышей взрослых возраста. Способность к обучению нейроны от взрослого возраста мышей позволяет использовать моделей заболеваний, которые проявляются в более позднем возрасте и может быть более умственно точным для некоторых исследований. Флуоресценции визуализации диссоциированных нейронов могут быть использованы для изучения деятельности населением нейронов, в отличие от использования электрофизиологии изучать один нейрон. Это особенно полезно при исследовании гетерогенную популяцию нейронов, в котором желаемый тип нейронов является редким, таких как, гипоталамических глюкозы зондирования нейронов. Мы использовали мембранного потенциала красителя визуализации взрослых вентромедиальных нейронов гипоталамуса изучать свои ответы на чаНГРЭС в внеклеточной глюкозы. Нейроны Глюкоза зондирования, как полагают, играют определенную роль в центральной регуляции энергетического баланса. Способность к обучению зондирования глюкозы у взрослых грызунов особенно полезно с преобладанием заболеваний, связанных с неблагополучной энергетического баланса (например. Ожирение) увеличивается с возрастом.
Introduction
Мозг регулирует энергетического гомеостаза через нейроэндокринной и вегетативной нервной системы. Вентромедиального гипоталамус (VMH), состоит из вентромедиального ядра (ВМН) и дугообразного ядра (ARC), имеет важное значение для центральной регуляции энергетического гомеостаза. Специализированный нейроны зондирования глюкозы, в VMH, ссылаются активность нейронов и периферийного гомеостаза глюкозы 1. Есть два типа глюкозы зондирования нейронов; глюкозы, возбуждаемые (GE) нейроны расти, а уровень глюкозы ингибирует (GI) нейроны уменьшить свою деятельность как внеклеточных глюкозы увеличивается. Нейроны VMH глюкозы зондирования, как правило, изучены с помощью электрофизиологии или потенциальную изображений чувствительный краситель кальция / мембраны.
Электрофизиологические техника патч зажим считается золотым стандартом при изучении экс естественных нейронной активности. В этой технике, стекло микропипетки электрод прикреплен к клеточной мембране с помощью высокой устойчивостью(ГОм) печать. Патч зажим электроды позволяют в режиме реального времени записи потенциала действия частоты (ток зажима) или ион проводимости (зажим напряжения) меняет в пределах одного нейрона. В то время как техника патч зажим предоставляет подробную информацию об изменениях в конкретных проводимостей ионных каналов, основным недостатком является то, что только один нейрон может наблюдаться одновременно. Это занимает примерно 30-45 мин записи, чтобы убедиться, что один находится в режиме записи от чувствительного к глюкозе нейрона даже до начала конкретного экспериментальное лечение. Кроме того, GI и GE нейроны составляют <20% от общей численности населения нейронов VMH. Усугубляет эту проблему, является отсутствие во многих случаях, из идентифицирующего сотовой маркера для этих нейронов. Таким образом, ясно, что, несмотря на ценную информацию электрический что другие методы не могут, анализ патч зажим является трудоемким, трудоемким и низкий выход.
Использование визуализации флуоресценции диссоциированных нейронов ВМХ позволяет для изучения хуndreds нейронов одновременно. Кальций чувствительные красители могут быть использованы для измерения внутриклеточного кальция изменений, которые косвенно коррелируют с изменением активности нейронов. Мембранный потенциал чувствительные красители используются для мониторинга изменений мембранного потенциала. Измерение сотовой мембранный потенциал является более прямой индекс активности нейронов по сравнению с изменениями в внутриклеточных уровней кальция. Кроме того, мембранный потенциал краситель (MPD) изображений потенциально распознает малейшие изменения мембранного потенциала, где потенциал действия стрельбы не изменяется и внутриклеточные уровни кальция может не измениться. Оба этих методов визуализации флуоресценции были использованы для изучения VMH нейроны чувствительных к глюкозе у мышей с ювенильного 2-7. В то время как результаты менее подробная, чем полученные с патч зажим электрофизиологии, прочность экспериментов изображений является то, что они одновременно оценить большое популяцию клеток, которые неизбежно включают в себя значительное количество глюкозы нейронами зондирования. MPD изображений яы особенно полезны для изучения GI нейроны, которые более равномерно локализован по всей VMH; таким образом обеспечивая адекватное население учиться в диссоциированной VMH (~ 15% GI). В отличие от этого, в то время как GE нейроны плотно локализованы в вентролатеральной-VMN и клеточной бедном регионе между АРК и VMN, они не представляют значительное число нейронов в пределах VMH (<1% GE). Кроме того, изучая изолированные нейроны, астроцитов и пресинаптические эффекты устраняются. Это может быть преимуществом в изучении последствий первого порядка нейронов, а также недостатком, поскольку физиологические соединений и процессов, будут потеряны.
Ограничивающим фактором в обоих патч зажим электрофизиологии и визуализации MPD / кальция красителя является необходимость использовать более молодых животных (например,. Мышей или крыс <возрасте 8 недель). Это преимущественно за счет увеличения соединительной ткани в сочетании с пониженной нейронной жизнеспособности, которое происходит с возрастом. В мозг-среза электрофизиологии шпильких годов, увеличилось соединительной ткани делает его более трудным для визуализации нейронов. Увеличение соединительной ткани также затрудняет отделить большое количество здоровых нейронов для визуальных исследований. Кроме того, нейроны от молодых животных живут дольше во время или записи патч зажим или изображений. Тем не менее, использование молодых мышей может быть основным ограничением. Активность нейронов и / или ответы на нейротрансмиттеров или циркулирующих питательных веществ меняются с возрастом. Например, так как энергетический баланс тесно связана с репродуктивного статуса, гипоталамуса нейроны, регулирующие энергетический баланс может иначе реагировать в предварительном против postpubescent животных. Кроме того, многие болезни требуют длительного лечения или не никак не проявляют до совершеннолетия. Ярким примером таких заболеваний являются пищевые ожирение или сахарный диабет 2 типа. Поскольку нейроны зондирования глюкозы, как полагают, играют определенную роль в этих болезней мы разработали методологию успешно культивирование здоровых взрослых VMH нейроны для использования в визуализации MPD ехрeriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключ к возможности изучить активность нейронов от взрослых мышей является возможность отделить здоровые нейроны. Разобщенность нейронов гипоталамуса от взрослых мышей сложнее в нескольких ключевых шагов в протоколе по сравнению с нейронами мышей несовершеннолетних. Мы преодолели э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
