Denna orthotopic modell av human prostatacancer möjliggör kvantifiering av tumörstorlek, cirkulerande tumörceller, och bildandet av distinkta metastaser i lungan. Eftersom cellerna måste fly den primära organ, in i blodbanan, och fäster sig en sekundär plats, denna modell rekapitulerar effektivt scenariot hos människor.
Vårt laboratorium har tagit fram en ny orthotopic implantation modell av human prostatacancer (PCA). Som PCa döden är inte på grund av den primära tumören, utan bildandet av distinkta metastaser, är förmågan att effektivt modellera denna progression pre-kliniskt av högt värde. I denna modell är celler direkt implanteras i den ventrala loben av prostata i BALB / c atymiska möss, och tilläts fortskrida under 4-6 veckor. Vid experiment uppsägning, kan flera olika ändpunkter mätas, till exempel storlek och molekylär karakterisering av primärtumör, närvaro och kvantifiering av cirkulerande tumörceller i blod och benmärg, och bildandet av metastaser i lungan. Förutom en mängd olika slutpunkter, ger denna modell en bild av en celler förmåga att invadera och fly den primära organ, in och överleva i cirkulationssystemet, och implantat och växa i en sekundär plats. Denna modell har använts på ett effektivt sätt för att mäta metastasersvar på både förändringar i proteinuttryck samt svar på småmolekylära terapi, i en kort handläggningstid.
Prostatacancer (PCA) är den vanligaste diagnosen cancer hos män och den näst vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i USA 1. Döden från PCa inte beror på bildandet av den primära tumören, utan bildandet av metastaser. Därför är förebyggande av metastaser hos patienter med hög vikt. Musmodeller av PCa erbjuder en mångfald av alternativ för att avslöja viktig biologisk information om denna sjukdom.
En mängd olika musmodeller av PCa existerar, var och en med inneboende fördelar och begränsningar. Även frekvensen av PCa hos människa är hög, är naturligt förekommande PCa extremt ovanligt i möss 2, trots lika känslighet möss övergripande till cancer 3. En gnagarart undantag är utveckling av PCA i Lobund Wistar-råttor, som kan uppnå hastigheter av PCa av 90% genom 12 månaders ålder via induktion av methylnitrosourea och testosteron 4. Därför inducerade modellsystem, såsom TRAMP(Transgen adenokarcinom i mus prostata) modell användes vanligen. Lufsen-modellen kan inducera transgenuttryck särskilt i prostata, och genomgår den normala utvecklingen av PCa, från hyperplasi till prostata intraepitelial neoplasi (PIN) till lymf-och lungmetastaser 5-6. Dessa modeller ger fördelarna av att kunna mäta hela skalan av tumörprogression, samt innehåller ett intakt immunsystem. Däremot kan de molekylära händelser som ligger till grund PCa utvecklingen skiljer sig åt mellan möss och människor, och korrelationer mellan möss och humana kliniska studier har visat variabilitet. Dessutom är båda dessa modeller är tidskrävande, som ett exempel den TRAMP-modellen kräver ungefär 28 veckor för att utveckla metastaser.
I att studera metastaser, är ofta en svans-ven eller vänster kammare injektion modell som används. Denna modell har nytta av snabb vändning tid, och kan dessutom mäta närvaron av skelett metastasär att använda särskilda cellinjer och villkor. Yang et al. Har rapporterat att subkutan injektion av GFP-positiva PC3-celler kan orsaka stor spridning benmetastaser 7, och svansvenen och intercardiac injektioner har också genererat skelettmetastaser utveckling 8-9. De huvudsakliga begränsningarna hos dessa modeller gäller avsaknaden av en primär tumör är bosatt inom prostatakörteln själv. Vidare, för modeller beroende av injektion av cancerceller in i cirkulationen, kringgår detta hela första halvan av den metastatiska kaskaden. Det utesluter därmed undersökning av första stegen, inklusive invasion genom den primära organ, som är biologiskt viktiga åtgärder för metastaserande förvandling. Många regulatorer av metastaserande förvandling direkt påverka tidiga cellinvasion. Tidiga steg i metastaserande kaskad utgör högprioriterade platser för terapeutisk inriktning, som när cancerceller sprider expanderar klonal variation kraftigt, vilket ökar biologiskal mångfald och minskande effektiv terapeutisk inriktning.
I ett försök att svara på många av de begränsningar av dessa modeller, har vårt laboratorium utvecklat ett orthotopic modell av human PCa där den mänskliga PCa PC3-M cellinje är direkt implanteras i prostatan av Balb / c-atymiska möss. Efter 4-6 veckor, kan tumörstorlek, förekomst av cirkulerande tumörceller (CTCs), och metastasering till lungorna och lymfkörtlar alla kvantifieras. Vi har i praktiken använt denna modell för att utvärdera effekten av 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) för att hämma human PCa metastaser 10. Dietary intag av genistein har kopplats till minskningar i prostatacancer metastaser och död 11-12, men tidigare ingen studie hade fastställt huruvida administration av genistein kan förändra PCa metastaser hos djur eller män. I denna studie visade vi att behandling med genistein kraftigt minskat antal lungmetastaser. Dessutom bestäms vi genistein alrade aktiveringen och uttrycket av flera viktiga pro-metastatiska proteiner i den primära tumören, inklusive fokal adhesion kinas (FAK), p38 mitogen-aktiverat proteinkinas (p38 MAPK) och värmechockprotein 27 (HSP27).
Dessa resultat överensstämde med observationer i kliniken. Med hjälp av blod från mössen, kunde vi noggrant mäta blodkoncentrationen av genistein och observerade dessa att likna nivåerna hos människor med vanliga kosten intag av genistein. Dessutom, en fas II-studie utförd av vår grupp bestämt att vid behandling med genistein, män erfarna minskningar i prostatavävnad mRNA uttryck av gener associerade med cellulär invasion och metastasering, särskilt matrixmetalloproteinas typ 2 (MMP-2) 13.
Vi har också använt denna modell för att utvärdera effekten av förändrad gen-produkt uttryck i den primära tumören på människors PCa metastaser 14. Tumören supprEssor endoglinen är en medlem av TGF-super och undertrycker mänskliga PCa cellulär invasion in vitro genom förändring av Smad signalering 15. Vi utökade dessa studier för att bestämma effekten av endoglin på människors PCa metastaser. Stabil endoglin knockdown, vektorkontroll eller endoglin över uttryck cellinjer implanteras i möss. Endoglin knockdown celler uppvisade det högsta antalet lungmetastaser, liksom CTCs i 38% av mössen. Möss implanterade med kontrollvektor visade ett medium respons, med mindre lungmetastas per mus, och CTCs i endast 18% av mössen. Hög endoglin implanterade möss visade nästan fullständig hämning av lungmetastaser, och fullständig hämning av CTCs.
Dessa är bara två exempel på de många olika tillämpningar av denna teknik har. Från läkemedelsforskning, till modellering förändringar i molekylärbiologi, har den här modellen en hög genomströmning metod för att utvärdera effekterna av olika funktioner på tumörtillväxt och mullvadkärlförändringar, förekomst av CTCs, och bildandet av distinkta metastaser i lungan och lymfkörtlar.
I denna skrift ger vi en ny musmodell av mänskliga PCa metastaser. I denna modell är den mänskliga PCa cellinjer PC3-M ortotopiskt implanteras direkt i prostata hos BALB / c-atymiska möss och tumörer fick utvecklas under 4-6 veckor. I resultaten avsnittet representativt visar vi exempel på data som kan samlas in, inklusive mus-vikt och livsmedelskonsumtion, tumörstorlek och vikt, molekylära egenskaper hos tumören, och bildning av distinkta metastas till lungan. Dessutom kan studeras ett stort antal extra utgångar beroende på särskilda forskningsintressen. Ett exempel är förekomsten av CTCs till blodet och benmärgen. Som CTCs är en relativt sällsynt händelse (vi observerar CTCs i cirka 5-20% av kontrolldjur), vi var inte förvånad över att ingen av de fem möss i dessa experiment utvecklade CTCs. Vårt laboratorium har också använt denna modell för att fastställa förändringar i cellulär adhesion genom att mäta kärn cellmorfologin iprostatavävnaden 10. Vi har också använt denna modell för att utvärdera primära tumör proliferation och apoptos status med hjälp av Ki67 och Tunel färgning av prostatatumör 14.
Förutom den mängd olika datautgångar som kan uppnås, kan denna modell användas för att bestämma effekterna av både förändringar i proteinuttryck samt småmolekylära läkemedel. Jämfört med många spontana och inducerade modeller av mänskligt PCa metastaser, det finns en högre handläggningstid på bara 4-6 veckor. Andra modeller med en hög handläggningstid, exempelvis svansvenen eller intercardiac injektion modeller, har begränsningar av någon primärtumör, alltså inte helt rekapitulera kliniken metastaserande kaskad. I vår modell, måste tumörceller undkomma den primära platsen för ursprung, in och överleva i cirkulationssystemet, och implantat till en sekundär plats. Detta ger ytterligare steg där en terapeutisk intervention eller förändringar i proteinuttryck kan leverera en effekt. Addinellt bör närvaron av den primära tumören möjliggöra enkel tillämpning av denna modell till nya avbildningstekniker, såsom luciferas-baserad IVIS 16-17.
Trots de många olika fördelar med denna modell, det finns också flera begränsningar att beakta. Allt fler studier visar betydelsen av immunsystemet i tumormicroenvironmenten och utveckling av metastaser 18. I denna modell på grund av användningen av en atymisk gnagare, inte är möjligt att förmågan att bedöma effekterna av immunförsvaret. En andra begränsning är att det saknas androgen responsiveness i PC3-M-celler. Vid första diagnos av PCa, patienter ofta genomgår androgenbehandling som en första linjens behandling. Dock kommer patienterna så småningom bli androgen-resistent och tumörer kommer att börja växa igen. Som PC3-M-celler saknar androgenreceptorn, den här modellen mäter enbart effekten av läkemedelsbehandling eller proteinmodulering på postandrogenresistent cancer. Även om detta är en begränsning, är androgen-lyhörd PCa närvarande väl hanterbar och har en mängd olika effektiva behandlingsalternativ, och därmed androgen-resistent cancer har blivit mer framträdande studeras. Denna modell också specifikt använder en inavlad stam av möss, vilket minimerar mus till mus-variabilitet. Dock kan denna stam vara särskilt lyhörda för särskilda proteiner eller små molekyler, så försiktighet bör iakttas vid extrapolering av dessa data till kliniken.
Även om denna modell ger en effektiv mätning av läkemedlets effektivitet på ett snabbt produktionstid av 4-6 veckor, kan detta inte hänsyn till långsiktiga läkemedelsdoseringseffekter. Efter långvarig exponering för många för närvarande tillgängliga behandlingar, kan patienterna återvända med läkemedelsresistenta cancer många år efter behandlingen. Den snabba vändningen av denna teknik tillåter inte effektiv modellering av möjligheten för en tumör att bli resistenta mot behandling. Men med modulering av denna exexperimentera, kan behandlingsresistenta humana prostatacancerceller implanteras, och effektiviteten i en andra generationens terapeutiskt att förebygga PCa tumörtillväxt och metastasering kan modelleras. Dessutom, om en grupp som försökte att studera de molekylära förändringar i en primärtumör över tid, en mer långsiktig modell såsom TRAMP modellen kommer sannolikt att bli mer effektiva för dessa studier.
En annan begränsning i denna modell är att sprida distinkta metastaser endast till lymfkörtlar och lungor hos djuren. Båda dessa platser är täta och kliniskt relevanta anläggningar metastaser, vilket framgår av humana varma obduktionsstudier 19. Dock utgör kliniskt benmetastaser ett framträdande inslag i mänsklig PCa, och därmed modellerna rekapitulera detta är av intresse. Tyvärr, dessa är svåra att sammanfatta i en musmodell, med mycket få modeller som visar skelettmetastaser utan svansvenen, intercardial injektion eller direkt implantation itill benet 20. Alltså, om inriktning på benet är av central experimentell betydelse, kan en annan modell vara effektivare. Men denna modell ger ett visst mått av trafik till benet i form av benmärg cirkulerande tumörceller.
Trots dessa begränsningar är denna teknik en kraftfull modell av human PCa. Förmågan att mäta effekter på både den primära tumören samt metastaserad bildningen på kort handläggningstid ger en mängd olika tillämpningar. I denna modell, måste celler undkomma den primära organ, in och överleva i blodet, och implantat i en sekundär plats, rekapitulera den process hos människor. Den extra mätning av molekylära egenskaper hos den primära tumören, förändringar i cell morfologi, och närvaron av cirkulerande tumörceller ger en bred fläkt av information från en modell. Detta förfarande kan användas både i samband med läkemedelsforskning samt att studera förändringar i tumörbiologi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (NIH) till RCB, CA122985 och prostata SPORE CA90386, och till JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Utbildning i åldersrelaterade sjukdomar", och av Walter S. Och Lucienne Driskill Graduate Program i Life Sciences vid Northwestern University. Vi vill också tacka Mouse Fenotypning och histologi laboratorium och patologi Core Facility vid Northwestern University.
Equipment | |||
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) | VWR | 95039-192 | |
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) | VWR | 94000-000 | |
Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ | Ethicon | Z304H | |
VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) | VWR | 82027-440 | |
Reagents | |||
Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
Buprenex | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
Formalin | VWR | 95042-908 | |
GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
Nembutal | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
Trizol | Invitrogen | 10296 |