Detta protokoll beskriver ett förfarande för snabb insamling av bilder av Arabidopsis plantor som reagerar till en gravitations stimulus använder kommersiellt tillgängliga flatbäddsskannrar. Metoden gör det möjligt för billig, hög volym fånga bilder med hög upplösning som kan bli föremål för efterföljande analysalgoritmer.
Forskningsinsatser i biologi kräver allt användningen av metoder som möjliggör stora volymer insamling av data med hög upplösning. En utmaning laboratorier kan möta är att utveckla och uppnå dessa metoder. Observation av fenotyper i en process av intresse är ett typiskt mål för forskningslaboratorier som studerar geners funktion och detta uppnås ofta genom bildfångst. En särskild process som är mottaglig för observation med hjälp av avbildning är den korrigerande tillväxten av en planta rot som har förskjutits från anpassningen till gravitation vektorn. Imaging plattformar som används för att mäta roten gravitropic svaret kan vara dyrt, relativt låg genomströmning, och / eller arbetsintensiv. Dessa frågor har behandlats genom att utveckla en hög genomströmning bildfångstmetod med hjälp av billiga, men ändå med hög upplösning, flatbäddsskannrar. Med denna metod kan bilder tagna med några minuters mellanrum på 4.800 dpi. Den nuvarande inställning möjliggör insamling av 216 individuella responses per dag. Bilddata som samlas in är av god kvalitet för bildanalystillämpningar.
Insamling av högupplösta fenotypisk information är användbar i studier som syftar till att förstå samspelet mellan genetik och miljö vid medieorganismfunktion 1,2. Studier av detta slag är också i sig av stor omfattning, vilket gör det dessutom nödvändigt att metoder som används för att mäta fenotyper i detta sammanhang vara hög i genomströmning 3,4. Vid upprättande av metoder för Phenomics forskning, kompromisser mellan genomströmning och upplösning spelar in. Metoder som är högre genomströmning också tenderar att vara lägre i upplösning, vilket gör det svårare att upptäcka små effekter av genetik eller miljö 5. Alternativt sätt att mer noggrant mäta en önskad fenotyp tenderar också att vara lägre i genomströmning, vilket gör det svårt att överblicka genetiska och miljöeffekter i stort sett. Dessutom kan manuella metoder för kvantifiering av fenotyper, inklusive visuell inspektion, ibland variera något beroende på skillnader i mänsklig pertagning 6.
Avbildningstekniker kan ge en användbar bro mellan genomströmning och upplösning att få fenotypiska observationer 7-9. I allmänhet är en bild med relativt lätt att fånga, underlättande genomströmning, och när det tas vid tillräcklig upplösning kan subtila fenotyper detekteras 1,2,7. Imaging tekniker tenderar att vara modifierbara för att passa ett system eller en process av intresse och är i allmänhet skalbar 10-12. På grund av detta, avbildningstekniker är idealiska för utveckling av storskaliga studier av organism funktion.
Svaret hos den primära roten till en gravitations stimulus är en invecklad fysiologisk process som inträffar inom en morfologiskt enkel orgel. Svaret handlar om aktivering av signalvägar som propagerar genom roten orgel och dess progression bestäms av miljömässiga och genetiska faktorer, inklusive genetiska faktorer miljöpåverkade 12-14 </sup>. Svaret från den primära roten till en gravitations stimulans har studerats åtminstone sedan Darwin, men det finns mycket att lära sig om hur det fungerar, särskilt i början av signaleringshändelser och i de faktorer som förmedlar svar plasticitet 12,14,15. Att få en detaljerad förståelse av dynamiken i detta svar är viktigt att hitta sätt att förbättra möjligheten för plantor att framgångsrikt etablera sig inom en given miljö 16. Dessutom gör formen av roten den mottaglig för bildbehandlingsprogram 8,12,17. Sammantaget är roten gravitropic svaret ett idealiskt system för utveckling av hög genomströmning bildteknik i syfte att genomföra studier av organism funktion genomik-nivå.
I denna rapport, är en hög kapacitet, hög upplösning metoden för bildfångst av roten gravitropic svaret med hjälp av billiga, kommersiellt tillgängliga flatbäddsskannrar presenteras. Den översikt överprotokoll visas i fig 1. Plantor planteras på agarplattor placerades vertikalt orienterade flatbäddsskannrar utrustade med anpassade Plexiglas platthållare. Bilder samlades med några minuters mellanrum på 4.800 dpi och sparas på en lokal enhet eller dataserver. Metadata i samband med varje bildserie lagras i en databas och de lagrade bilderna bearbetas. Den metod använder VueScan programvara för bildfångst. VueScan kan användas för att köra över 2.100 olika scanners på Windows, Mac eller Linux-operativsystem (se Material tabell). En scanner upplösning på 4800 dpi användes i denna ansökan för att matcha upplösningen uppnåtts i tidigare studier med fasta CCD-kameror 1,8,12. Flexibiliteten i VueScan programvara tillsammans med den gemensamma gränssnitt den använder för någon skanner det körs tillåter användare att snabbt anta praktiskt taget alla skannern av tillräcklig upplösning för att det protokoll som presenteras i detta dokument. Aktuell genomströmning möjliggör insamling av216 individuella svar per dag. Tekniken är anpassningsbar och skalbar för användning vid institutioner allt från gymnasieskolor till forskning universitet. Dessutom, de insamlade bilderna är av tillräcklig kvalitet för bildanalystillämpningar.
Exakt fenotypisk observation är avgörande för att förstå de manifestationer av geners funktion i en organism. Ett sätt att skaffa fenotypisk information genom avskiljning av högupplösta bilddata. Skannern-baserad plattform som utvecklats har möjlig samling av många bilder (200 bilder / scan period) med hög upplösning (4800 dpi) under ett antal timmar. Dessutom är denna plattform lätt anpassas till en mängd olika lab och klassrumsmiljöer på grund av flexibiliteten i VueScan programvara för att köra tusentals olika skannrar med ett gemensamt gränssnitt 18.
Den metod som presenteras här fyller ett tomrum i hög genomströmning ta bilder som sträcker sig från storskaliga fenotypning anläggningar och automatiserade system genomförbara i ett enda laboratorium. De hög kapacitet plattformar tillgängliga tenderar att använda specialiserad imaging hårdvara, inklusive kameror monterade på robot stöd, för att fånga högupplösta bilder av primarily ovan jord växtvävnader (t.ex. Centrum för växt Integrative Teknik och Scanalyzer HTS av LemnaTec) 20,21. Specialiserade bildsystem som använder röntgen och MRI tekniker har också utvecklats för att bilden nedan mark vävnader med anmärkningsvärd upplösning när de växer i jorden miljön (t.ex. centrum för växt Integrative Technology) 11,22,23. Denna utveckling av mer specialiserad teknik är i allmänhet på bekostnad av genomströmning, vilket gör dynamiska fenotypiska studier svårare. Viktigt är kostnads-och infrastrukturbehov för dessa avancerade plattformar gör dem oftast omöjligt att genomföra i mindre laboratorier.
Plattformar har också utvecklats som använder mer standardbild capture-teknik och är väl lämpad för mätning av dynamiska svar som roten svar på en gravitations stimulans. Till exempel har CCD-kameror har använts för att fånga individuella plantor svar på ljus och allvar vid högtidsmässiga och geografiska 1,8,12. Andra system har utvecklats för att tillåta mätning av rotspets orientering av multipla rötter från en enda bild (t.ex. RootTipMulti från iPlant Collaborative) 17,24. I det förra fallet är genomströmningen relativt låg eftersom endast en fröplanta avbildas av varje kamera i taget, medan i det senare fallet genomströmningen är högre, men i allmänhet på bekostnad av upplösning.
Det förfarande som beskrivs i detta dokument utgör en plattform för att fånga högupplösta bilder med hög genomströmning med utrustning och mjukvara som är lätt tillgängliga och relativt prisvärd. Med hjälp av denna inställning, kan 1080 individuella rot svaren samlas varje vecka i ett enda laboratorium utrustat med en bank av sex scanners. Under 15 månader för att samla i genomsnitt 864 individuella svar i veckan, har totalt 41.625 plantor skannas för en genomik studie. Om 15% av de enskilda samlingar misslyckades på grund av inställningsfelet, och kork fel eller felaktig utrustning. Ytterligare 22% svar misslyckades på grund av brist på groning eller otillräcklig rottillväxt att framkalla en tillväxtsvar. Den sista datapost består av 27.475 individuella plant svar på en gravitations stimulans från 163 rekombinanta inavlade linjer plus 99 nära isogena linjer. Uppgifterna samlades in i ett enda laboratorium, vilket gör detta till en mycket hög genomströmning metod. Även med tanke på att den utrustning som används för förvärvet är relativt billig, den har fungerat tillförlitligt i över två år även med tung användning.
Även om detta protokoll har varit till stor nytta för de forsknings målen i denna grupp, finns vissa begränsningar fortfarande. På grund av genomströmningen av ungefär 50 GB okomprimerade bilddata per dag, var det uppenbart att en stor mängd utrymme behövdes till hus bilder om inte effektiva komprimeringsmetoder kan utvecklas. Lagrings problemet tillfälligt löst genom att köpa externa hårddiskar för varje dator. Dessutom, två 10 TB nätverks tillhörande lagringsenheter köptes. Senare var komprimeringsalgoritmer utvecklats, såsom beskrivits ovan, vilket kan bidra till att minska datastorleken med upp till 60% (figur 8). Det är viktigt att notera att den hastighet med vilken data kan sparas till ett nätverk associerad lagringsenhet är beroende av hastigheten på nätverksanslutningen. Komprimeringsprogram har också begränsad på grund av en önskan att förhindra förlust av bilddata.
Andra begränsningar som är specifika för en skanner-baserade bildsystem övervägs också. Till exempel i en skanner baserad metod plantor utsätts för hög intensitet ljus i de vita och potentiellt infraröda intervall under varje skanning. Detta påverkar sannolikt planttillväxt, även om plantorna fortfarande kan observeras att genomgå robusta svar på en gravitations stimulus (Figur 7). En framtida förbättring skulle kunna innebära programmering scanners så att endast infraröda lysdioder är aktiva. Ett område i aktiv UTVECKLINGt är skapandet av analysalgoritmer väl anpassade till den upplösning och genomströmning av dessa bilddata. Den stora datamängden som genereras med hjälp av denna skanner-baserad metod har varit idealisk för utveckling av robusta verktyg för high-throughput fenotypning av plantbilder. Den komprimeringsalgoritm används på dessa bilder som visas i figur 7 har stöd för påståendet att de är mottagliga för bild analysprogram. Dessutom kan bilder som genereras att analyseras av tidigare publicerade algoritmen, RootTrace 17,24, om de samlas vid lägre upplösning (mindre än 1200 dpi), och individuella plantor segment från bilden med hjälp av komprimeringsalgoritm som beskrivs ovan före analys. Rottillväxt data kan extraheras från bilderna reduceras till 1200 dpi, medan spetsvinkeldata kan extraheras från bilder reduceras till 900 dpi (opublicerad observation).
Det förfarande som beskrivs i detta dokument passar in i sin egen nisch i världen av Root avbildning i att det är hög genomströmning och hög upplösning samtidigt som den är relativt billig. En ytterligare fördel med denna metod är att den lätt kan anpassas för att tillgodose bildbehov av en viss forskningsgrupp.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats genom ett bidrag från National Science Foundation (utmärkelse nummer IOS-1.031.416) och har genomförts i samarbete med Nathan Miller, Logan Johnson och Edgar Spalding vid University of Wisconsin och Brian Böckelman, Carl Lundstedt och David Swanson i University of Nebraska Holland Computing Center.
Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |