Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

18.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50889

⸱

19 oktober 2013

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We hebben een nieuwe en reproduceerbare techniek om primaire culturen van pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC) isoleren van muizen zo jong als P7 ontwikkeld, waardoor een betere studie van de signaalwegen betrokken bij neonatale gladde spiercellen samentrekken en ontspannen mogelijk.

Samenvatting

Pulmonale hypertensie is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij zuigelingen. Historisch gezien, is er sprake van aanzienlijke studie van de signaalwegen betrokken bij vasculaire gladde spiercontractie in PASMC uit foetaal schapen. Terwijl schapen een uitstekende model duur pulmonale hypertensie, ze zijn erg duur en niet de voordelen van genetische manipulatie in muizen. Omgekeerd, het onvermogen om PASMC isoleren van muizen was een belangrijke beperking van dit systeem. Hier beschrijven we de isolatie van primaire kweken van muizen PASMC van P7, P14 en P21 muizen met een variant van de eerder beschreven techniek van Marshall et al.. 26 die eerder werd gebruikt voor rat PASMC isoleren. Deze muizen PASMC vormen een nieuw instrument voor de studie van signaalwegen in de neonatale periode. Kort, een suspensie van 0,5% (w / v) agarose + 0,5% ijzerdeeltjes in M199 medium wordt toegediend in de pulmonale vasculaire bed via de rechter ventrikel (RV). Deijzerdeeltjes zijn 0,2 micrometer in doorsnede en kan niet door de pulmonale capillaire bed. Zo is het ijzer lodges in de kleine longslagaders (PA). De longen worden opgeblazen met agarose, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden naar beneden getrokken met een magneet. Na collagenase (80 U / ml) behandeld en na dissociatie, worden de kolven op een weefselkweekschaal in M199 medium met 20% foetaal bovine serum (FBS) en antibiotica (M199 complete media) gebracht celmigratie doorlaat tot de kweekschaal . Deze eerste plaat van cellen is een 50-50 mengsel van fibroblasten en PASMC. Aldus wordt de pull down procedure meerdere malen herhaald om een ​​meer pure PASMC bevolking te bereiken en verwijder eventueel resterende ijzer. Gladde spiercellen identiteit wordt bevestigd door immunokleuring voor gladde spieren myosine en desmine.

Inleiding

Pulmonale hypertensie is normaal tijdens intrauterine leven omdat de placenta fungeert als het belangrijkste orgaan van gasuitwisseling en slechts 10% van het hartminuutvolume wordt gecirculeerd door de pulmonaire vasculaire bed. In utero, pulmonale drukken zijn vergelijkbaar met systemische druk vanwege verhoogde pulmonale vaatweerstand . Als zwangerschap vordert, is er een snelle groei van de kleine PA binnen de longen, de voorbereiding van de foetus voor de dramatische stijging van de doorbloeding van de longen die optreedt bij de geboorte 1. Wanneer de normale perinatale overgang faalt in korte termijn en voldragen kinderen, het resultaat is persisterende pulmonale hypertensie van de pasgeborene (PPHN). PPHN is een klinisch syndroom dat wordt veroorzaakt door verschillende onderliggende pathologie. Echter, al deze kinderen hebben gemeenschappelijke pathofysiologische kenmerken, zoals verhoogde pulmonale vaatweerstand, hypoxemie, en rechts-naar-links-shunting van de bloedstroom in heel hardnekkige foetale verbindingen zoals de ductus arteriosus of vooramen ovale. PPHN beïnvloedt 2-6 per 1000 levendgeborenen en brengt een 8-10% risico op sterfte en aanzienlijke korte termijn en lange termijn morbiditeit 2. Bovendien kunnen zeer laag geboortegewicht prematuren pulmonale hypertensie ontwikkelen als gevolg van de onderliggende longaandoening. De meest voorkomende onderliggende longaandoening bij prematuren is bronchopulmonale dysplasie (BPD). Terwijl het totale risico op BPD correleert met de zwangerschapsduur en geboortegewicht, blijft het onduidelijk waarom een ​​subset van deze kinderen ontwikkelt significante pulmonale hypertensie en hoe adequaat te behandelen deze zuigelingen. Slechte resultaten, met inbegrip van langdurige ziekenhuis verblijven en verhoogde mortaliteit, komen vaak voor 3-6.

Historisch gezien hebben schapen foetale PASMC of varkens foetale PASMC van gezonde dieren die zijn gebruikt om de signaalwegen betrokken bij de normale longvaten overgang na de geboorte te bestuderen. Deze zijn meestal geïsoleerd van de vijfde generatie weerstand PA van eenn schapen of varkens foetus die wordt geleverd en gedood vóór elke spontane ademhaling 7-9. Daarnaast hebben sommige onderzoekers geïsoleerd en gebruikt PASMC van iets oudere en spontaan ademende lammeren en biggen op 3 dagen, 2 weken, en 4 weken 10-12. Meer recent, hebben sommige groepen met succes geïsoleerd en gebruikt PASMC geïsoleerd van lammeren met PPHN aan de derangements onderzoeken signaalwegen in de ziekte staat 13-17. Deze cellen hebben bewezen een waardevol instrument om te onderzoeken welke signaalwegen zijn cruciaal in zowel de normale en zieke op korte termijn en de termijn longvaatbed zijn. Echter, hebben ze geen inzicht geven in de signaalwegen beïnvloed bij prematuren met pulmonale hypertensie. Ook maken zij de mogelijkheden van genetische manipulatie gezien in muismodellen van ziekte.

Rat en muis modellen zijn al lange tijd gebruikt om het model BPD en meer recentelijk worden gebruikt om het model pulmonale hypertension gevolg van BPD 18-22. Neonatale ratten zijn verleidelijk om mee te werken als gevolg van hun grotere omvang, maar ze ook last hebben van een gebrek aan mogelijkheden voor genetische modificatie. Genetisch gemodificeerde dieren zijn uitgebreid gebruikt om de effecten van bepaalde gendoelstellingen in gehele dierlijke fysiologie bij neonatale muizen te onderzoeken, maar tot nu toe niemand eerder succesvol geïsoleerd PASMC Uit deze muizen. Door het isoleren PASMC kan meer informatie worden verkregen over routes veranderen als reactie op prikkels uit de omgeving en / of genetische modificatie specifiek in de longslagader gladde spieren. Daarnaast kan levend PASMC worden afgebeeld in real time om snelle veranderingen in belangrijke signaalmoleculen zoals calcium en zuurstofradicalen 23-25 ​​te onderzoeken. We hebben onlangs beschreven succesvolle isolatie van PASMC van volwassen muizen met een variant van de techniek van Marshall et al.. 26 gebruikt voor het isoleren rat PASMC 23,25,26. We hebben nu een aangepastnd uitgebreid deze techniek om kleine muizen 7-21 dagen leeftijd (P7, P14 en P21). De belangrijkste beperking van deze nieuwe PASMC isolatietechniek is dat het meerdere muizen voldoende cellen voor experimenten genereren en dat de cellen groeien zeer langzaam, die kenmerkend primaire gladde spiercellen. Ondanks deze beperkingen, geloven wij deze techniek neonatale muis PASMC isolaat zal voor de versterkte onderzoek van de belangrijkste signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van longhypertensie en vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in dit gebied.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd dit protocol.

1. Longslagader Isolatie van neonatale muizen - Day One

  1. Bereid de complete M199 media - Mix 400 ml M199 met 100 ml (eindconcentratie = 20%) warmte geïnactiveerd FBS en 5 ml (eindconcentratie = 1%) penicilline / streptomycine.
  2. Bereid de Serum Gratis M199 Media - Mix 500 ml M199 met 5 ml (eindconcentratie = 1%) penicilline / streptomycine.
  3. Bereid de PA Agarose - Mix 0,05 g agarose plus 0,05 g ijzerdeeltjes in 10 ml steriel, serum-vrij M199 media.
  4. Bereid de Lung Agarose - Mix 0,1 g agarose in 10 ml steriel, serum-vrij M199 media.
  5. Bereid de collagenase - Mix collagenase in steriele, serumvrije media M199 bij een uiteindelijke concentratie van 80 U / ml en vervolgens steriel filter dit mengsel.
  6. Set-up van al het van tevoren apparatuur voordat euthanizing de muis.
  7. Stel PA agarose en longen agarose naar rechts koken alvorens euthanizing de muis.
  8. Euthanaseren de muis in het verdovingsmiddel pot met isofluraan overdosis en wees voorzichtig met de muis pup in contact te komen met de isofluraan niet toe te staan. De beste cel opbrengst wordt verkregen wanneer de cellen onmiddellijk na de dood worden geoogst om micro-stolsels vormen die in het verkeer na dood te voorkomen.
  9. Verwijder de muis uit de narcose pot, zet de muis om het operationele bestuur, en steriliseer de muis, instrumenten, en handschoenen met alcohol.
  10. Laad de scalpel met het blad en incise de muis van de nek tot de inferieure buik.
  11. Open de buik aan de linkerkant van de muis, bloot de nieren, en snijd de nierslagader om de muis te exsanguinate, waardoor stolsels te voorkomen in de kleine bloedvaten van de longen.
  12. Gebruik een schaar om langs de linkerkant van de muis te snijdenhet borstbeen aan de borstkas te openen.
  13. Zorgvuldig gebruik scalpel om het diafragma aan beide kanten te snijden en de borstholte volledig open. Gebruik een tang of pennen om de borstholte open te houden.
  14. Plak de camper met een 27 G ½ inch naald gericht op de PA en perfuseren de RV / PA / longen met steriel PBS tot de longen verschijnen witte (alle bloed gespoeld uit de pulmonale circulatie). Dit duurt ongeveer 3-5 ml PBS duren afhankelijk van de grootte van de muis. Het is belangrijk om eerst te spoelen om stolselvorming in de kleine longvaten te voorkomen.
  15. Zorgvuldig gebruik van stompe dissectie van de luchtpijp en de draad een hechtdraad eronder bloot te leggen.
  16. Zet de kleinste tang onder de luchtpijp voor steun en zet het 24 G angiocatheter in de luchtpijp. Plaats de angiocatheter alsof het plaatsen van een IV.
  17. Beveilig de angiocatheter in de luchtpijp met de hechtdraad geregen in stap 1.16.
  18. Neem kokend PA agarose uit kokend water, en keer goed te mengen. Koel de agarose tot ongeveer lichaamstemperatuur door wervelende op ijs. De agarose moet in oplossing blijven, maar niet zo warm dat de cellen van de PA beschadigen.
  19. Plak de camper met een 27 G ½ inch naald en perfuseren de RV / PA / longen met PA agarose totdat de longen worden grijs weergegeven. De ijzerdeeltjes in de agarose mengsel maakt de longen lijken grijs van kleur. Dit duurt ongeveer 3-5 ml agarose PA afhankelijk van de grootte van de muis nemen. Het is ook belangrijk om langzaam gaan als te snel injecteren kan leiden het strijkijzer lekken in de luchtwegen.
  20. Neem de long agarose uit kokend water en keer goed te mengen. Koel vervolgens de agarose tot ongeveer lichaamstemperatuur door wervelende op ijs. De agarose moet in oplossing blijven, maar niet zo warm dat de cellen van de longen beschadigen.
  21. Het opstellen van de long agarose en bevestig de spuit om de 24 G angiocatheter in de luchtpijp. Bezielen de agarose via de luchtpijp naar de longen vol lucht. De longen zijn easier om gehakt (zie latere stappen) als de longen op passende wijze worden opgeblazen.
  22. Verwijder de hart-long blok, en dompel het in 25 ml ijskoude PBS om de agarose (ca. 5 min.) stollen. Gebruik deze tijd om het schoonmaken van de chirurgische gebied.
  23. Voor neonatale muizen (P7-P21), de beste PASMC opbrengst komt van het combineren 2-3 pups in een batch van cellen. PASMC liever in contact met andere cellen voor optimale cel gezondheid en groei. Als men de muis wordt gebruikt per isolatie, dan de cellen zijn zeer schaars en niet goed groeien. Wanneer ze samen combineren dieren, oogst en chill het hart-long blokken en vervolgens te verplaatsen naar hakken zodra alle hart-long blokken zijn verwijderd uit de dieren.
  24. Ga naar de celkweek kap voor steriliteit vanaf dit punt verder.
  25. Plaats de gekoelde longen in de deksel van de 10 cm weefselkweek schotel en het hart, thymus, luchtpijp en eventuele bindweefsel uit de longen verwijder voorzichtig.
  26. Verplaats de longen naar de bodem van de 10 cm weefselkweekschaalen voeg ongeveer 1 ml ijskoude steriele PBS.
  27. Hak de longen in zeer kleine stukjes (1-2 mm) met 2 scalpels.
  28. Breek de tip van een steriele 5 ml serologische pipet. Pipet gehakt long drijfmest in steriele 50 ml conische buis. Met extra steriel ijskoud PBS wassen van de plaat te verzekeren dat alle longweefsel krijgt in de 50 ml conische buis.
  29. Plaats de ml conische buis 50 op de magneet. Wacht tot de ijzer bevattende weefsel om naar opzij van de buis naast de magneet. Afhankelijk van de verhouding van ijzer-bevattende vaartuig longweefsel, sommige vaten kunnen nog te zweven op dit punt. Aspireren van de PBS langzaam en voorzichtig proberen niet te drijven longweefsel te zuigen omdat het onduidelijk is wanneer het schepen bevat.
  30. Was de pellet long 3x met 5 ml steriel PBS, opnieuw proberen de hoeveelheid longweefsel dat is opgezogen minimaliseren.
  31. Resuspendeer de pellet in long 3 ml collagenase en giet in 60 mm weefselkweekplaat. Nietprobeer deze pipet, de longen brokken zal vasthouden aan het interieur van uw pipet.
  32. Met nog 3 ml op de buis na het gieten spoelen en giet dit in 60 mm weefselkweekplaat ook.
  33. Plaats in de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
  34. Pipet weefsel + collagenase drijfmest op en neer met een 15 G stompe naald op een 5 ml spuit totdat alle grote long stukken worden verstoord. Het weefsel + collagenase drijfmest zal op dit punt helder zijn, zonder zichtbare weefsel brokken.
  35. Giet in een nieuwe steriele 50 ml conische buis en hechten aan de magneet.
  36. Was de weefselkweekschaal met ongeveer 5 ml compleet M199 media te verzekeren dat al het weefsel is verzameld en giet dit in de conische buis.
  37. Aspireren van de collagenase + media supernatant. Deze keer zullen er zeer weinig floaters, en een compacte ijzerhoudende pellet zal zijn aan de kant van de conische buis naast de magneet.
  38. Was met 5 ml compleet media 3x. Dit is nodig om de collagenase inactiveren.
  39. Voeg 3 ml compleet medium, en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
  40. Giet de geresuspendeerde pellet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop, zullen er kleine fragmenten vat circuleren met ijzerdeeltjes in het vat lumen.
  41. Plaats de weefselkweek schotel (gelabeld plaat nul) in de weefselkweek incubator 's nachts. De eerste cellen af ​​te migreren naar bord nul zijn ongeveer 50% fibroblasten en 50% PASMC, gebaseerd op kleuring voor gladde spieren markers. Deze plaat heet plated nul en uiteindelijk weggegooid na de daaropvolgende verrijking stappen.

2. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Day Two

  1. Giet de media supernatant van plaat nul in een schone 50 ml conische buis.
  2. Aspireren uit de media supernatant. Deze keer zullen er bijna geen floaters, en een compacte ijzer-containing pellet wordt gevormd op de zijde van de conische buis naast de magneet.
  3. Was met 5 ml volledige media 3x.
  4. Voeg 3 ml compleet medium, en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
  5. Giet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop worden kleine vaartuigen fragmenten zweven rond met ijzerdeeltjes in het vat lumen gezien. Dit zal een plaat (Figuur 1A).
  6. Plaats de weefselkweek schotel in de weefselkweek incubator.

3. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Day Six

  1. Giet de media supernatant van de plaat een in een schone 50 ml conische buis. Herhalen van deze stap meerdere keren verzekert dat alle gladde spiercellen in de wand van het vat verblijven de gelegenheid af migreren op een celcultuurplaat. Er is een afnemende rendement bij elke stap dwz elke plaat zal minder en minder cellen hechten.
  2. Opnieuw invoeren plaat een met volledige M199 media, en plaats terug in de weefselkweek incubator.
  3. Aspireren uit de media supernatant. Deze keer wordt bijna geen floaters en een compacte ijzer bevattende pellet wordt gevormd op de zijde van de conische buis naast de magneet.
  4. Was met 5 ml volledige media 3x.
  5. Voeg 3 ml compleet medium, en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
  6. Giet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop worden kleine vaartuigen fragmenten zweven rond met ijzerdeeltjes in het vat lumen gezien. Dit zal plaat twee.
  7. Plaats de weefselkweek schotel in de weefselkweek incubator.

4. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Dag Negen

  1. Giet de media supernatant uit de weefselkweek schotel plaat twee in een schone 50 ml conische buis.
  2. Opnieuw invoeren plaat twee met volledige M199 media, en plaats terug in de weefselkweekincubator.
  3. Aspireren uit de media supernatant. Deze keer wordt bijna geen floaters en een compacte ijzer bevattende pellet wordt gevormd op de zijde van de conische buis naast de magneet.
  4. Was met 5 ml volledige media 3x.
  5. Voeg 3 ml van complete media en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
  6. Giet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop worden kleine vaartuigen fragmenten zweven rond met ijzerdeeltjes in het vat lumen gezien. Dit zal plaat drie.
  7. Plaats de weefselkweek schotel in de weefselkweek incubator.

5. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Dag Dertien

  1. Verstuif de media af van de platen 1-3.
  2. Voorzichtig wassen van de cellen met warme, steriele PBS.
  3. Voeg een dunne film van trypsine (~ 0,25-0,5 ml) trypsine aan elke plaat te trypsinize uit cellen. Cellen zijn zeer hechtend en moeten in trypsine bevattende weefsel culture incubator voor ongeveer 10 min op te heffen van de plaat.
  4. Oogst cellen van de platen in 5 ml volledige media in een 50 ml conische buis bevestigd aan de magneet te trekken uit eventueel resterende ijzerdeeltjes.
  5. Was beide platen met een extra 0,5 ml compleet medium en toevoegen dat media om de 50 ml conische buis.
  6. Deze keer, neem de media supernatant (niet aspireren), en gooi de ijzerdeeltje pellet.
  7. Plaat de cellen in 5 ml compleet medium M199 in een 60 mm schaal tot confluente cellen in een paar dagen. Als alternatief, het bord van de cellen in 10 ml compleet M199 media in een 10 cm plaat, en PASMC zal nog ongeveer 1-2 weken duren tot confluentie bereiken.

6. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Dag Veertien

  1. Verander de media om verse volledige M199 media om eventueel resterende trypsine te verwijderen. Er zal een dunne bevolking van PASMC op de weefselkweek schotel (Figuur 1B) zijn.

7. Routine Care

  1. Verander de media om verse volledige M199 media ongeveer 2x per week.
  2. Bij het splitsen van deze cellen, ongeveer 10 min in de incubator in een film van trypsine (0,25-0,5 ml) vereist voor de cellen op te heffen van de plaat. Met behulp van de trypsine film laat opnieuw platen van de PASMC zonder stoppen met draaien van de cellen. Als teveel trypsine wordt gebruikt, de PASMC worden gecentrifugeerd te spinnen de trypsine of de cellen niet readhere de plaat. Soms, nadat de cellen af ​​te draaien, is het moeilijk om de PASMC geresuspendeerd in compleet medium M199 krijgen.
  3. In observaties, de geïsoleerde PASMC gedragen als gladde spiercellen betrouwbaar voor 4-5 passages, maar de geïsoleerde cellen zal vlek voor gladde spiercellen markers tot passage 7. Tel de eerste gepoolde 60 mm of 10 cm plaat op dag dertien als doorgang 2 (plating na de eerste blootstelling aan trypsine).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Tijdens en na isolatie, zijn PASMC onderzocht zowel met lichtmicroscopie en door immunokleuring voor gladde spiercellen markers. Met lichtmicroscopie in het begin van het protocol, worden PASMC gezien migreren naar de weefselkweek schotel uit de kleine ijzeren opslagvaten (Figuur 1A). Na pooling platen een tot drie op dag dertien, dan ijzerdeeltjes zijn niet langer gezien als die zijn uitgevoerd in de laatste pooling stap getrokken. In plaats daarvan, een populatie van PASMC wordt gezien op de weefselkw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit manuscript beschrijven we voor het eerst de isolatie van PASMC van muizen op P7, P14 en P21. Om dit te bereiken, wordt een suspensie van agarose en 0,2 uM ijzerdeeltjes toegediend langs de RV in de PA. Vanwege de kleine omvang van de ijzerdeeltjes, kunnen ze niet door de pulmonale capillaire bed en zijn dus afgezet in de kleine PA. De longen worden opgeblazen, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden getrokken uit de oplossing met behulp van een magneet. Uiteindelijk worden de schepen uitgeplaat ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH HL109478 (KNF). De auteurs erkennen en dank Gina Kim en Joann Taylor voor hun hulp bij het isoleren en het handhaven van de PASMC in de cultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bard Parker chirurgisch bladhandvatBD371030
Roestvrijstalen chirurgische bladen #10 (steriel)Miltex4-310
Spuiten (3 ml en 5 ml, steriele)BD309657 en 306646
Naalden (27 G, steriele)BD305109
Angiocathether (24 G, steriele)BD381412
Monoject stompe canule (15 G)KendallSWD202314Z
HechtdraadFisher ScientificNC9782896
Dynal magneet deeltje collectorInvitrogen120-01DDit is een cruciaal hulpmiddel voor het protocol.
Weefselkweek platen (35 mm, 60 mm en 10 cm, steriele)BD353001, 353004, en 353003Elke merk van weefselkweek platen zal goed zijn.
Iris schaar (4 ½ inch roestvrij staal)American Diagnostic Corporation3424
Pincetten (4 inch roestvrij staal)Quick MedicalL5-5004
D-PBSMediatech21-031-CV
M199 mediaMediatech10-060-CV
Penicilline/streptomycineVWRTX16777-164NWU
Foetaal bovien serumHyclone/Thermo ScientificSH3091003Verwarm inactiveren bij 55 °C gedurende 45 min. Voor consistentie in resultaten, lot match al serum en verkrijg van dezelfde leverancier.
IJzerdeeltjes (ijzer (II, III) oxide poeder)Aldrich Chemical Company#31,006-9
AgaroseSigmaA9539
Collagenase (gemaakt tot 80 U/ml)SigmaC5138
IsofluraanButlet ScheinNDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U met een Cascade Photometrics 12-bit cameraNikonTE2000-UElke goede lichtmicroscoop zal goed zijn om PASMC in cultuur te observeren.
Anti-desmin antilichaamSigmaD-8281Gebruik bij 1:200 verdunning voor immunokleuring.
Anti-gladde spier myosineBiomedical TechnologiesBT-562Gebruik bij 1:2,000 verdunning voor immunokleuring.
Rhodamine-rood anti-konijn secundairMolecular Probes/InvitrogenR-6394Gebruik bij 1:200 verdunning voor immunokleuring.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescente microscoop en Cool Snap digitale cameraNikonTE300Elke goede epifluorescentie microscoop zal goed zijn voor immunokleuring.
Cyclische nucleotide fosfodiësterase assay kitEnzo Life SciencesBML-AK800-0001Dit is de enige colorimetrische PDE enzym activiteit assay die beschikbaar is.
SildenafilSigmaPZ-0003Een PDE5-selectieve inhibitor is vereist voor de PDE enzym activiteit om specificiteit van cGMP hydrolyse te bepalen.

Referenties

  1. Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
  2. Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
  3. Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
  4. Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
  5. Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
  6. Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
  7. Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
  8. Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
  9. Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
  10. Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
  11. Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
  12. Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
  13. Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
  14. Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
  15. Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
  16. Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
  17. Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
  18. Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
  19. Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
  20. de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
  21. de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30(2009).
  22. Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
  23. Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
  24. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
  25. Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
  26. Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
  27. Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van neonatale muizeninfusie van ijzerdeeltjesmagnetische vaatscheidingweefselvertering met collagenasemigratie van celculturenimmunofluorescentiekleuringgladspiermarkersagarose-ijzersuspensieweefselkweekschaal
Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.