הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Summary

שתואר כאן היא שיטה למדידה ישירה ניצוצות סידן, היחידות יסודי של Ca ^{2 +} שחרור מreticulum sarcoplasmic בסיבי שריר שלד בשלמותה. בשיטה זו משתמשת האוסמוטי-תיווך מתח מפעילה של Ca ^{2 +} שחרור מקולט ryanodine בסיבי שריר מבודדים. יכולים להיות מועסק הדינמיקה ויכולת homeostatic של Ca ^{2 +} איתות תאית כדי להעריך את תפקוד שרירים בבריאות ובחוליים.

Abstract

שמירה על האיתות ⁺ homeostatic Ca ² היא תהליך פיסיולוגי בסיסי בתאים חיים. Ca ^{2 +} ניצוצות הם היחידות היסודיים של Ca ^{2 +} האיתות בסיבי השריר המפוספס שמופיעים מקומיים כמאוד ² אירועי שחרור Ca ⁺ מתווכים על ידי קולטן ryanodine (RyR) Ca ^{2 +} לשחרר ערוצים בreticulum sarcoplasmic (SR) בממברנה. הערכה נכונה של השרירים Ca ^{2 +} ניצוצות יכולים לספק מידע על Ca ^{2 +} מאפייני טיפול תאיים של שרירים משורטטים בריאים וחולים. למרות Ca ^{2 +} ניצוצות אירועים נראים בדרך כלל בשריר לב במנוחה, הם נשמרים רק לעתים נדירות במנוחת סיבי שריר שלד, ולכן יש צורך בשיטות להפקת ולנתח ניצוצות בסיבי שריר שלד.

המפורטים כאן הוא פרוטוקול ניסוי למדידת Ca ^{2 +} ניצוצות בdigitorm brevis סיבי שריר מכופף מבודד (FDB) באמצעות fluorescent Ca ^{2 +} דדים ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. בגישה זו, סיבי FDB מבודדים נחשפים ללחץ hypoosmotic חולף ואחרי חזרה לפתרון פיסיולוגי איזוטוני. בתנאים אלה, Ca ^{2 +} חזק ניצוצות התגובה מזוהה סמוכה לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר צעירים ובריאים FDB. Ca ^{2 +} שינה ניצוצות תגובה מזוהה בסיבי שריר שלד dystrophic או בגיל. גישה זו הוכיחה לאחרונה כי איתות מופרדת קרום מעורב דיבורים צולבים בין אינוסיטול (1,4,5)-אדנוזין קולט (IP ₃ R) וRyR תורם לCa ^{2 +} ניצוץ הפעלה שברירי שלד. לסיכום, המחקרים שלנו באמצעות לחץ האוסמוטי מושרה Ca ^{2 +} ניצוצות הראו כי תגובה תאית זו משקפת שרירים איתות מנגנון בפיזיולוגיה והזדקנות / מדינות מחלה, כולל מודלים עכבר של ניוון שרירים (MDX עכברים) או טרשת לרוחב amyotrophic (מודל ALS).

Introduction

Ca בחינם תאית ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) הוא שליח משני צדדי וחשוב המווסת את התפקודים תאיים רבים בתאים להתרגש כגון תאי עצב, לב, שלד ושרירים חלקים (לסקירה ראה Stutzmann ^ו1 Mattson). מוסדר Ca ^{2 +} וגיוס דיבורים צולבים בין reticulum sarcoplasmic (SR) ו-T-אבובית קרומים (TT) הם רגולטורים בסיסיים של פיזיולוגיה שרירים. יתר על כן, שינויים בCa ^{2 +} איתות שהוכחו כמנגנון בסיסי של תפקוד לקוי של התכווצות במחלות שרירים שונות.

Ca ^{2 +} ניצוצות מקומיים אירועי Ca ^{2 +} שחרור יסודיים שמקורם הפתיחה של הקולטן ryanodine הערוץ (RyR) על reticulum sarcoplasmic הקרום (SR) ^2. בשריר לב, ניצוצות להתרחש באופן ספונטני באמצעות פתיחת ערוץ RyR2 ידי Ca ² Ca ^{2 +} rele ^+-InducedASE (CICR) ^3-5 מנגנון. בשרירי שלד, RyR1 נשלט בקפידה על ידי חיישן המתח ^ב6,7 קרום TT. כך Ca ^{2 +} ניצוצות מדוכאים וזוהו רק לעתים נדירות בתנאי מנוחה בסיבי שריר שלד בשלמותה. עד לאחרונה, קרום sarcolemmal הדרוש כדי להיות מופר על ידי שיטות שונות כימיות או מכאניות "הפשטה" לנתק את הדיכוי של חיישן המתח על RyR1 ואיפשר לCa ^{2 +} להצית אירועים כדי להתגלות בשרירי שלד ^8,9. שיטה אחת שתוארה קודם לכן permeabilization הנדרש של הקרום של סיבי שריר על ידי saponin חומר ניקוי ^10.

ב2003, גילו שגם מתח hypoosmotic חולף או מתח hyperosmotic יכול לגרום Ca ההיקפי ^{2 +} ניצוצות סמוכים לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר בשלמות ^11. שיטה זו מאז שונתה כדי ללמוד את המנגנון ואפנון המולקולריים של Ca ^{2 +} </sup> שחרור ודינמיקת ^12-16. כאן אנו מתארים את הפרטים של הגישה הניסויית שלנו לזירוז, זיהוי וניתוח של Ca ^{2 +} ניצוצות בשרירי שלד בשלמותה. אנו מציגים גם התכנית שלנו שהותקן ניצוץ הניתוח שיכול לשמש כדי לכמת את המאפיינים הבסיסיים של Ca ^{2 +} ניצוצות בודדים בשרירי שלד, לדוגמא תדר ניצוץ ומשרעת (Δ F/F0, המשקף את ההסתברות הפתוחה של ערוצי RyR ו Ca ^{2 +} המטען בתוך SR); זמן להגיע לשיא (זמן עלייה) ומשך (FDHM, משך מלא במשרעת חצי מקסימלי) של ניצוצות, כמו גם את ההתפלגות המרחבית של Ca ^{2 +} ניצוצות. בנוסף, אנו מציגים ראיות המקשרת שינו Ca ^{2 +} ניצוצות למדינות השונות pathophysiological בשרירי שלד, כגון ניוון שרירים וטרשת לרוחב amyotrophic.

היתרון של שיטה זו כרוך ביכולת למדוד Ca ^{2 +} ביחסית undamתאי בני, במקום להפשיט את סיבי השריר, המאפשרים הקלטה של Ca ^{2 +} ניצוצות בתנאים קרובים יותר לפיסיולוגיים. בנוסף, התכנית המותאמת במיוחד שלנו מספקת חישובים מדויקים יותר של המאפיינים של הניצוץ ביחס לסיבי שריר.

Protocol

1. הגדרת מערכת זלוף אוסמוטי מתח איור 1 הוא פרוטוקול סכמטי של סידן ניצוצות הערכה בסיבי שריר שלד בשלמותה. הגדר את micromanipulator שלושה צירים (XYZ) מסוגל מיקום קצה היציאה של מערכת זלו…

Representative Results

מחקרים קודמים הראו כי לחץ hypoosmotic חולף + מושרה Ca ההיקפי 2 ניצוצות בסמוך לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר בשלמות 11. איור 1 מציג את התמונות של סיבי שריר בודדים שלמים עם קרום sarcolemmal חלק ופסים ברורים אופייניים. איור 2 מראה Ca הטיפוסי 2 + ניצוצו…

Discussion

שיטה זו של הערכת Ca ^{2 +} ניצוצות בשרירי שלד בשלמותה היא כלי שימושי לפיזיולוגית שרירים ומחקר מחלה. הראינו כי תגובת Ca ^{2 +} הניצוץ שונתה בתנאים שונים, כולל ניוון שרירי ^11, הזדקנות ^{_18, 19,} כמו גם בטרשת לרוחב amyotrophic ^20. המחקר שנערך לאחרונה שלנו חשף ג…

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation