Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Summary

Se describe aquí un método para medir directamente las chispas de calcio, las unidades elementales de la liberación de ^{Ca2 +} desde el retículo sarcoplásmico en las fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica estrés mediada por activación de Ca ^{2 +} liberación del receptor de rianodina en fibras musculares aisladas. La dinámica y la capacidad homeostática del ^{Ca2 +} intracelular de señalización pueden emplearse para evaluar la función muscular en la salud y la enfermedad.

Abstract

El mantenimiento de la homeostasis de Ca ⁺ de señalización ² es un proceso fisiológico fundamental en las células vivas. Ca ^{2 +} chispas son las unidades elementales de la Ca ^{2 +} señalización en las fibras musculares estriadas que aparecen como muy localizada Ca ^{2 +} eventos liberación mediada por el receptor de rianodina (RyR) Ca ^{2 +} en libertad canales en el retículo sarcoplásmico (SR) de la membrana. La correcta valoración de los músculos ^de Ca ^{2 +} chispas podrían proporcionar información sobre los intracelulares de Ca ^{2 +} inmuebles manipulación de los músculos estriados sanos y enfermos. Aunque Ca ^{2 +} chispas eventos se observan con frecuencia en los cardiomiocitos de descanso, rara vez se observan en reposo fibras del músculo esquelético, por lo que existe una necesidad de métodos para generar y analizar las chispas en las fibras musculares esqueléticas.

Detallada aquí es un protocolo experimental para la medición de Ca ^{2 +} chispas en digitorm brevis (FDB) fibras musculares aisladas flexores utilizando fluorescent Ca ^{2 +} indicadores y microscopía confocal de barrido láser. En este enfoque, las fibras de FDB aislados están expuestos a estrés hipoosmótica transitorio seguido de un retorno a la solución fisiológica isotónica. En estas condiciones, un robusto Ca ^{2 +} chispas respuesta se detecta adyacente a la membrana del sarcolema en las fibras musculares FDB jóvenes sanos. Alteración del Ca ^{2 +} chispas se detecta respuesta en las fibras musculares esqueléticas distróficas o de edad avanzada. Este enfoque ha demostrado recientemente que la señalización de la membrana delimitado por la participación de la diafonía entre inositol (1,4,5)-trifosfato del receptor (IP ₃ R) y RyR contribuye a Ca ^{2 +} activación chispa en el músculo esquelético. En resumen, nuestros estudios utilizando el estrés osmótico de Ca inducido por ^{2 +} chispas mostraron que esta respuesta intracelular refleja un músculo mecanismo de señalización en la fisiología y envejecimiento / estados de enfermedad, incluyendo modelos de ratón de la distrofia muscular (MDX ratones) o esclerosis lateral amiotrófica (ALS modelo).

Introduction

Intracelular de Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) es un mensajero secundario versátil e importante que regula múltiples funciones celulares en las células excitables como las neuronas, cardiaco, esquelético y músculo liso (para revisión ver Stutzmann y Mattson ^1). Regulado Ca ^{2 +} movilización y la diafonía entre retículo sarcoplásmico (SR) y T-túbulos (TT) membranas son reguladores fundamentales de la fisiología del músculo. Además, se han mostrado cambios en Ca ^{2 +} señalización ser un mecanismo subyacente de la disfunción contráctil en varias enfermedades musculares.

Ca ^{2 +} chispas se localizan eventos Ca ^{2 +} liberación elementales procedentes de apertura del receptor de rianodina (RyR) de canal en el retículo sarcoplásmico (SR) de la membrana ^2. En el músculo cardiaco, las chispas se producen de forma espontánea a través de la apertura del canal de RyR2 por una Ca ^{2 +} inducida por Ca ^{2 +} release (CICR) mecanismo de ^3-5. En el músculo esquelético, RyR1 está estrictamente controlado por el sensor de voltaje en la membrana de ^6,7 TT. Así Ca ^{2 +} chispas se suprimen y raramente detectado en condiciones de reposo en las fibras musculares esqueléticas intactas. Hasta hace poco, la membrana del sarcolema necesaria para ser interrumpido por diversos métodos químicos o mecánicos "desollar" para desacoplar la supresión del sensor de voltaje en RyR1 y se dejó para el Ca ^{2 +} provocar eventos a ser detectado en el músculo esquelético ^8,9. Un método descrito anteriormente requiere la permeabilización de la membrana de las fibras musculares por detergente saponina ^10.

En 2003, se descubrió que, o bien el estrés hipoosmótica transitoria o estrés hiperosmótico podrían inducir Ca ^{2 +} chispas periférica adyacente a la membrana del sarcolema de las fibras musculares intactas ^11. Este método ya ha sido modificado para estudiar el mecanismo molecular y la modulación de Ca ^{2 +} </sup> Comunicado y la dinámica ^{de 12-16.} Aquí resumimos los detalles de nuestro enfoque experimental para la inducción, la detección y el análisis de Ca ^{2 +} chispas en el músculo esquelético intacto. También presentamos nuestro programa de análisis de chispa a la medida que se puede utilizar para cuantificar las propiedades elementales de los distintos Ca ^{2 +} chispas en el músculo esquelético, por ejemplo, la frecuencia de la chispa y la amplitud (Δ f/f0, que refleja la probabilidad de apertura de los canales RyR y el Ca ^{2 +} carga en el interior del SR), el tiempo hasta el pico (tiempo de subida) y la duración (FDHM, lleno de duración en mitad de la máxima amplitud) de chispas, así como la distribución espacial de Ca ^{2 +} chispas. Además, se presenta evidencia que vincule alterado de Ca ^{2 +} chispas a los diversos estados fisiopatológicos en el músculo esquelético, como la distrofia muscular y la esclerosis lateral amiotrófica.

La ventaja de esta técnica consiste en la capacidad de medir el Ca ^{2 +} en relativamente sin dañoscélulas envejecidas, en vez de pelar las fibras musculares, lo que permite la grabación de Ca ^{2 +} chispas en condiciones más cerca fisiológica. Además, nuestro programa de diseño personalizado proporciona cálculos más precisos de las propiedades de la chispa en relación a las fibras musculares.

Protocol

1. Configuración de estrés osmótico sistema de perfusión La figura 1 es un protocolo esquemático de calcio chispas evaluación en las fibras musculares esqueléticas intactas. Establecer un micromanipulador de tres ejes (XYZ), capaz de colocar la punta de salida del sistema de perfusión que contenga un mínimo de dos canales. Esto podría hacerse con desechable barril Luer-jeringa con adjunta tres – forma Luer – Lok llave de paso para encen…

Representative Results

Estudios anteriores mostraron que el estrés hipoosmótica transitoria inducida Ca periférica 2 + chispas adyacente a la membrana del sarcolema en las fibras musculares intactas 11. Figura 1 muestra las imágenes de las fibras musculares individuales intactas con la membrana del sarcolema suave y estrías claras característicos. Figura 2 muestra típica de Ca 2 + chispas (como imágenes xy) se indujeron por tratamiento transitorio (100 seg) co…

Discussion

Este método de evaluación de Ca ^{2 +} chispas en el músculo esquelético intacto es una herramienta útil para la fisiología muscular y la investigación de la enfermedad. Hemos demostrado que la respuesta de Ca ^{2 +} chispa fue alterada en diferentes condiciones, incluyendo la distrofia muscular ^11, el envejecimiento ^{18, _19,} así como en la esclerosis lateral amiotrófica ^20. Nuestro reciente estudio también reveló acoplamiento funcional entre la PI <s…

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation