I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Summary

Beskrivs här är en metod för att direkt mäta kalcium gnistor, de elementära enheter av ^{Ca2 +} släppa från sarko retiklet i intakta skelettmuskelfibrerna. Denna metod använder osmotisk stress medierad utlösning av Ca ^{2 +} frisättning från ryanodinreceptorn i enstaka muskelfibrer. Dynamiken och homeostatiska kapacitet intracellulär ^{Ca2 +-signalering} kan användas för att bedöma muskelfunktion i hälsa och sjukdom.

Abstract

Att upprätthålla homeostatiska ^{Ca2 +-signalering} är en grundläggande fysiologisk process i levande celler. Ca ^{2 +-gnistorna} är de elementära enheter av ^{Ca2 +-signalering} i tvärstrimmiga muskelfibrer som visas som mycket lokal Ca ^{2 +} frisättning händelser medierade av ryanodinreceptorn (RyR) ^{Ca2 +} släppa kanaler på sarko retikulum (ER)-membranet. Korrekt bedömning av muskel ^{Ca2 +-gnistor} skulle kunna ge information om de intracellulära ^{Ca2 +} hanteringsegenskaper för friska och sjuka tvärstrimmiga musklerna. Trots att ^{Ca2 +} gnistor händelser är vanliga i vila cardiomyocytes, de är sällan hos vilande skelett muskelfibrer, och därför finns det ett behov av metoder för att generera och analysera gnistor i skelettmuskelfibrerna.

Detaljerad här är ett experimentellt protokoll för mätning av Ca ^{2 +-gnistor} i isolerade flexor digitorm brevis (FDB) muskelfibrer använder fluorescent ^{Ca2 +-indikatorer} och laserskanning konfokalmikroskopi. I detta synsätt, är isolerade FDB fibrer utsätts för övergående hypoosmotisk spänning följt av en återgång till isoton fysiologisk lösning. Under dessa förhållanden gnistor en robust ^{Ca2 +,} svar detekteras i anslutning till sarcolemmal membranet hos unga friska FDB muskelfibrer. Altered ^{Ca2 +} gnistor svar detekteras i dystrofiska eller åldrade skelettmuskelfibrerna. Detta tillvägagångssätt har nyligen visat att membranavgränsade signalering omfattar överhörning mellan inositol (1,4,5)-trifosfat-receptorn (IP ₃ R) och RyR bidrar till ^{Ca2 +} gnista aktivering i skelettmuskulaturen. Sammanfattningsvis våra studier med osmotisk stress Ca ^{2 +} gnistor visade att denna intracellulära svar reflekterar en muskel signaleringsmekanismen inom fysiologi och åldrande / sjukdomstillstånd, inklusive musmodeller av muskel dystrofi (mdx möss) eller amyotrofisk lateralskleros (ALS modell).

Introduction

Intracellulär fri Ca ^{2 + ([Ca2 +]} _i) är en mångsidig och viktig sekundär budbärare som reglerar flera cellulära funktioner i retbara celler såsom neuroner, hjärt-, skelett-och glatt muskulatur (för översikt se Stutzmann och Mattson ^1). Reglerad Ca ^{2 +} mobilisering och överhörning mellan sarko retiklet (SR) och T-tubuli (TT) membran är grundläggande regulatorer av muskelfysiologi. Dessutom förändringar i ^{Ca2 +-signalering} hade visat sig vara en underliggande mekanism av kontraktil dysfunktion i olika muskelsjukdomar.

^{Ca2 +-gnistor} är lokaliserade elementära Ca ^{2 +} frisättning händelser härrör från öppningen av ryanodinreceptorn (RyR) kanal på sarko retiklet (SR) membran ^2. I hjärtmuskeln, gnistor uppstår spontant genom öppnandet av RyR2 kanalen med en ^{Ca2 +-inducerad Ca2 +} release (CICR) mekanism ^3-5. I skelettmuskulatur, är RyR1 noga kontrolleras av spänningssensorn vid TT membran ^6,7. Således Ca ^{2 +-gnistor} undertrycks och sällan upptäcks i vilande förhållanden i intakta skelettmuskelfibrerna. Tills nyligen, till sarcolemmal membranet behövde störas av olika kemiska eller mekaniska "flås" metoder för att koppla loss undertryckandet av spänningssensorn på RyR1 och tillåtet för ^{Ca2 +} gnista händelser som ska detekteras i skelettmuskel ^8,9. En metod som tidigare beskrivits krävs permeabilization av membranet av muskelfibrer genom saponin tvättmedel ^10.

År 2003 upptäckte vi att antingen övergående hypoosmotisk stress eller hyperosmotisk stress kan inducera perifer ^{Ca2 +} gnistor intill sarcolemmal membranet i intakta muskelfibrer ^11. Denna metod har sedan modifierats för att studera den molekylära mekanismen, och modulering av Ca ^{2 +} </sup> utsläpp och dynamik ^12-16. Här redogör vi detaljerna i vår experimentella metod för induktion, detektion och analys av Ca ^{2 +-gnistor} i intakt skelettmuskulatur. Vi presenterar också våra specialbyggda spark analys program som kan användas för att kvantifiera de elementära egenskaper hos enskilda ^{Ca2 +-gnistor} i skelettmuskulaturen, t ex tänd frekvens och amplitud (Δ f/f0, vilket speglar den öppna sannolikheten för Ryr-kanaler och Ca ^{2 +} belastning inne i SR), tid till maximal (stigtid) och varaktighet (FDHM, full varaktighet vid halv-maximal amplitud) av gnistor, samt den rumsliga fördelningen av Ca ^{2 +-gnistor.} Dessutom presenterar vi bevis som länkar förändrad ^{Ca2 +-gnistor} till de olika patofysiologiska tillstånd i skelettmuskulaturen, såsom muskeldystrofi och amyotrofisk lateralskleros.

Fördelen med denna teknik innefattar förmågan att mäta Ca ^{2 +} i relativt fria från skadoråldrade celler, istället för strippmuskelfibrerna, vilket gör inspelning av Ca ^{2 +} gnistor i förhållanden närmare fysiologiska. Dessutom ger vårt specialutformat program mer exakta beräkningar av egenskaperna hos den gnista i förhållande till muskelfibrerna.

Protocol

1. Ställa in Osmotisk-stress Perfusion System Figur 1 är en schematisk protokoll av kalcium gnistor bedömning i intakta skelettmuskelfibrerna. Sätt upp en tre-axeln (xyz) mikromanipulator kapabel att placera utloppsspets perfusionssystemet innehåller minst två kanaler. Detta kan göras med engångs Luer-sprutbehållare med bifogad tre – sätt Luer – Lok kranen för att slå på och / eller stänga av flödet av infusionsvätskor. Dessa infu…

Representative Results

Tidigare studier har visat att övergående hypoosmotisk stressen inducerad perifer Ca2 + sparks intill sarcolemmal membranet i intakta muskelfibrer 11. Figur 1 visar bilder av intakta enstaka muskelfibrer med blank sarcolemmal membranet och karakteristiska tydliga strimmor. Figur 2 visar typiska Ca 2 + gnistor (som xy-bilder) inducerades av övergående (100 sek) behandling med en hypoosmotisk lösning som sväller de FDB muskelfibrer från ung…

Discussion

Denna metod för att bedöma Ca ^{2 +-gnistor} i intakt skelettmuskel är ett användbart verktyg för muskelfysiologi och forsknings sjukdom. Vi visade att Ca ^{2 +} gnista responsen ändras under olika förhållanden, inklusive muskeldystrofi ^11, åldrande ^{18, _19,} såväl som i ALS ^20. Vår senaste undersökning visade också funktionell koppling mellan IP _3-receptorn och RyR representerar en kritisk komponent som bidrar till Ca ^{2 +-gnistor</s…}

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation