Beskrivs här är en metod för att direkt mäta kalcium gnistor, de elementära enheter av Ca2 + släppa från sarko retiklet i intakta skelettmuskelfibrerna. Denna metod använder osmotisk stress medierad utlösning av Ca 2 + frisättning från ryanodinreceptorn i enstaka muskelfibrer. Dynamiken och homeostatiska kapacitet intracellulär Ca2 +-signalering kan användas för att bedöma muskelfunktion i hälsa och sjukdom.
Att upprätthålla homeostatiska Ca2 +-signalering är en grundläggande fysiologisk process i levande celler. Ca 2 +-gnistorna är de elementära enheter av Ca2 +-signalering i tvärstrimmiga muskelfibrer som visas som mycket lokal Ca 2 + frisättning händelser medierade av ryanodinreceptorn (RyR) Ca2 + släppa kanaler på sarko retikulum (ER)-membranet. Korrekt bedömning av muskel Ca2 +-gnistor skulle kunna ge information om de intracellulära Ca2 + hanteringsegenskaper för friska och sjuka tvärstrimmiga musklerna. Trots att Ca2 + gnistor händelser är vanliga i vila cardiomyocytes, de är sällan hos vilande skelett muskelfibrer, och därför finns det ett behov av metoder för att generera och analysera gnistor i skelettmuskelfibrerna.
Detaljerad här är ett experimentellt protokoll för mätning av Ca 2 +-gnistor i isolerade flexor digitorm brevis (FDB) muskelfibrer använder fluorescent Ca2 +-indikatorer och laserskanning konfokalmikroskopi. I detta synsätt, är isolerade FDB fibrer utsätts för övergående hypoosmotisk spänning följt av en återgång till isoton fysiologisk lösning. Under dessa förhållanden gnistor en robust Ca2 +, svar detekteras i anslutning till sarcolemmal membranet hos unga friska FDB muskelfibrer. Altered Ca2 + gnistor svar detekteras i dystrofiska eller åldrade skelettmuskelfibrerna. Detta tillvägagångssätt har nyligen visat att membranavgränsade signalering omfattar överhörning mellan inositol (1,4,5)-trifosfat-receptorn (IP 3 R) och RyR bidrar till Ca2 + gnista aktivering i skelettmuskulaturen. Sammanfattningsvis våra studier med osmotisk stress Ca 2 + gnistor visade att denna intracellulära svar reflekterar en muskel signaleringsmekanismen inom fysiologi och åldrande / sjukdomstillstånd, inklusive musmodeller av muskel dystrofi (mdx möss) eller amyotrofisk lateralskleros (ALS modell).
Intracellulär fri Ca 2 + ([Ca2 +] i) är en mångsidig och viktig sekundär budbärare som reglerar flera cellulära funktioner i retbara celler såsom neuroner, hjärt-, skelett-och glatt muskulatur (för översikt se Stutzmann och Mattson 1). Reglerad Ca 2 + mobilisering och överhörning mellan sarko retiklet (SR) och T-tubuli (TT) membran är grundläggande regulatorer av muskelfysiologi. Dessutom förändringar i Ca2 +-signalering hade visat sig vara en underliggande mekanism av kontraktil dysfunktion i olika muskelsjukdomar.
Ca2 +-gnistor är lokaliserade elementära Ca 2 + frisättning händelser härrör från öppningen av ryanodinreceptorn (RyR) kanal på sarko retiklet (SR) membran 2. I hjärtmuskeln, gnistor uppstår spontant genom öppnandet av RyR2 kanalen med en Ca2 +-inducerad Ca2 + release (CICR) mekanism 3-5. I skelettmuskulatur, är RyR1 noga kontrolleras av spänningssensorn vid TT membran 6,7. Således Ca 2 +-gnistor undertrycks och sällan upptäcks i vilande förhållanden i intakta skelettmuskelfibrerna. Tills nyligen, till sarcolemmal membranet behövde störas av olika kemiska eller mekaniska "flås" metoder för att koppla loss undertryckandet av spänningssensorn på RyR1 och tillåtet för Ca2 + gnista händelser som ska detekteras i skelettmuskel 8,9. En metod som tidigare beskrivits krävs permeabilization av membranet av muskelfibrer genom saponin tvättmedel 10.
År 2003 upptäckte vi att antingen övergående hypoosmotisk stress eller hyperosmotisk stress kan inducera perifer Ca2 + gnistor intill sarcolemmal membranet i intakta muskelfibrer 11. Denna metod har sedan modifierats för att studera den molekylära mekanismen, och modulering av Ca 2 + </sup> utsläpp och dynamik 12-16. Här redogör vi detaljerna i vår experimentella metod för induktion, detektion och analys av Ca 2 +-gnistor i intakt skelettmuskulatur. Vi presenterar också våra specialbyggda spark analys program som kan användas för att kvantifiera de elementära egenskaper hos enskilda Ca2 +-gnistor i skelettmuskulaturen, t ex tänd frekvens och amplitud (Δ f/f0, vilket speglar den öppna sannolikheten för Ryr-kanaler och Ca 2 + belastning inne i SR), tid till maximal (stigtid) och varaktighet (FDHM, full varaktighet vid halv-maximal amplitud) av gnistor, samt den rumsliga fördelningen av Ca 2 +-gnistor. Dessutom presenterar vi bevis som länkar förändrad Ca2 +-gnistor till de olika patofysiologiska tillstånd i skelettmuskulaturen, såsom muskeldystrofi och amyotrofisk lateralskleros.
Fördelen med denna teknik innefattar förmågan att mäta Ca 2 + i relativt fria från skadoråldrade celler, istället för strippmuskelfibrerna, vilket gör inspelning av Ca 2 + gnistor i förhållanden närmare fysiologiska. Dessutom ger vårt specialutformat program mer exakta beräkningar av egenskaperna hos den gnista i förhållande till muskelfibrerna.
Denna metod för att bedöma Ca 2 +-gnistor i intakt skelettmuskel är ett användbart verktyg för muskelfysiologi och forsknings sjukdom. Vi visade att Ca 2 + gnista responsen ändras under olika förhållanden, inklusive muskeldystrofi 11, åldrande 18, 19, såväl som i ALS 20. Vår senaste undersökning visade också funktionell koppling mellan IP 3-receptorn och RyR representerar en kritisk komponent som bidrar till Ca 2 +-gnistor</s…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av RO1-AG028614 till JM, RO1-AR063084to NLW, och RO1-AR057404 till JZ.
Dissecting microscope | Dissect out fibers and check muscle integrity | ||
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps | Fine Science Tools | ||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | DOW CORNING | 184 SIL ELAST KIT | Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate. |
60-mm glass petri dish | Pyrex | 3160 | Fiber dissection |
Isotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
Minimal Ca2+ Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
Hypotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
collagenase type I | Sigma-Aldrich | C-5138 | Fiber digestion |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluorescent Ca2+ imaging dyes |
TMRE | Invitrogen | T669 | mitochondrial membrane potential fluorescent dyes |
Delta TPG dishes | Bioptechs | 0420041500C | 35 mm glass bottom dish for imaging |
Spark Fit software | data analysis software | ||
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | ||
3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
temperature controllable orbital shaker | New Brunswick scientific | Fiber dissociation |