Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Summary

Décrit ici est une méthode pour mesurer directement les étincelles de calcium, les unités élémentaires de Ca ^{2 +} libèrent de réticulum sarcoplasmique dans les fibres musculaires squelettiques intacts. Cette méthode utilise le stress osmotique-médiée déclenchement de la libération de Ca ^{2 +} du récepteur de la ryanodine dans les fibres musculaires isolées. La dynamique et la capacité d'homéostasie intracellulaire de Ca ^{2 +} signalisation peuvent être utilisés pour évaluer la fonction musculaire dans la santé et la maladie.

Abstract

Le maintien de la signalisation ^{de Ca2 +} homéostatique est un processus physiologique fondamental dans les cellules vivantes. Ca ^{2 +} étincelles sont les unités élémentaires de Ca ^{2 +} de signalisation dans les fibres musculaires striées qui apparaissent comme très localisée Ca ^{2 +} événements de relâchement à médiation par récepteur de la ryanodine (RyR) Ca ^{2 +} libérer les canaux sur le réticulum sarcoplasmique (SR) de la membrane. Une évaluation correcte du muscle Ca ^{2 +} étincelles pourraient fournir des informations sur les intracellulaires Ca ^{2 +} propriétés de manipulation des muscles striés sains et malades. Bien que Ca ^{2 +} étincelles événements sont fréquemment observées dans les cardiomyocytes de repos, ils sont rarement observés dans reposant fibres musculaires squelettiques; ainsi il existe un besoin de procédés pour générer et analyser des étincelles dans les fibres musculaires squelettiques.

Détaillé ici est un protocole expérimental pour la mesure de Ca ^{2 +} des étincelles dans fléchisseurs isolé digitorm brevis (FDB) des fibres musculaires en utilisant fluorescent Ca ^{2 +} indicateurs et la microscopie à balayage laser confocal. Dans cette approche, les fibres FDB isolés sont exposés à un stress hypo-osmotique transitoire suivie d'un retour à une solution physiologique isotonique. Dans ces conditions, un solide de Ca ^{2 +} suscite la réponse est détecté à proximité de la membrane du sarcolemme dans les fibres jeunes sains FDB musculaires. Altered Ca ^{2 +} suscite réponse est détectée dans les fibres musculaires squelettiques dystrophiques ou âgés. Cette approche a récemment démontré que la signalisation de membrane délimitée impliquant la diaphonie entre inositol (1,4,5)-triphosphate récepteur (IP ₃ R) et RyR contribue à Ca ^{2 +} de l'activation de la bougie dans le muscle squelettique. En résumé, nos études utilisant stress osmotique Ca ^{2 +} induite étincelles ont montré que cette réponse intracellulaire reflète un muscle mécanisme de signalisation dans la physiologie et le vieillissement / états pathologiques, y compris des modèles de souris de la dystrophie musculaire (souris mdx) ou la sclérose latérale amyotrophique (modèle de la SLA).

Introduction

Libre intracellulaire de Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) est un messager secondaire polyvalent et important qui réglemente plusieurs fonctions cellulaires dans les cellules excitables comme les neurones, cardiaque, squelettique et les muscles lisses (pour revue, voir Stutzmann et Mattson ^1). Réglementé mobilisation de ^{Ca2 +} et la diaphonie entre le réticulum sarcoplasmique (SR) et T-tubule (TT) membranes sont des régulateurs fondamentaux de la physiologie musculaire. En outre, ont été représentés les changements dans la signalisation de Ca ^{2 +} à un mécanisme sous-jacent de dysfonctionnement contractile dans diverses maladies musculaires.

Ca ^{2 +} sont localisés étincelles événements de Ca ^{2 +} de libération élémentaires provenant de l'ouverture du récepteur de la ryanodine (RyR) de canal sur le réticulum sarcoplasmique (SR) de la membrane ^2. Dans le muscle cardiaque, des étincelles se produisent spontanément par l'ouverture du canal RyR2 par un Ca ^{2 +} induite par le Ca ^{2 +} pertiase (CICR) mécanisme ^3-5. Dans le muscle squelettique, RyR1 est strictement contrôlé par le capteur de tension au niveau de la membrane ^6,7 TT. Ainsi Ca ^{2 +} étincelles sont supprimées et rarement détectés dans des conditions de repos dans les fibres musculaires squelettiques intacts. Jusqu'à récemment, la membrane du sarcolemme devait être perturbé par divers procédés chimiques ou mécaniques "écorcher" pour désaccoupler la suppression du capteur de tension et sur ​​RyR1 autorisée pour Ca ^{2 +} déclencher des événements qui doivent être détectés dans le muscle squelettique ^8,9. Une méthode décrite précédemment requis perméabilisation de la membrane des fibres musculaires par la saponine détergent ^10.

En 2003, nous avons découvert que le stress soit hypoosmotique transitoire ou de stress hyperosmotique pourraient induire Ca ^{2 +} périphérique étincelles à proximité de la membrane du sarcolemme dans les fibres musculaires intactes ^11. Cette méthode a depuis été modifié pour étudier le mécanisme moléculaire et de modulation du Ca ^{2 +} </sup> libération et dynamique ^12-16. Nous exposons ici les détails de notre approche expérimentale pour l'induction, la détection et l'analyse de Ca ^{2 +} des étincelles dans le muscle squelettique intact. Nous vous présentons également notre programme d'analyse étincelle sur mesure qui peut être utilisée pour quantifier les propriétés élémentaires des différents Ca ^{2 +} des étincelles dans le muscle squelettique, par exemple la fréquence d'allumage et d'amplitude (Δ f/f0, qui reflète la probabilité d'ouverture des canaux RyR et la charge ⁺ Ca ² à l'intérieur du SR); temps au pic (temps de montée) et la durée (FDHM, durée totale au amplitude demi-maximale) d'étincelles, ainsi que la distribution spatiale de Ca ^{2 +} étincelles. En outre, nous présentons des preuves que modifiée Liens Ca ^{2 +} étincelles aux différents états physiopathologiques dans le muscle squelettique, comme la dystrophie musculaire et la sclérose latérale amyotrophique.

L'avantage de cette technique consiste à mesurer la capacité de Ca ^{2 +} dans relativement undamcellules âgées, au lieu de dépouiller les fibres musculaires, permettant l'enregistrement de Ca ^{2 +} des étincelles dans des conditions plus proches de physiologique. En outre, notre programme conçu sur mesure fournit des calculs plus précis des propriétés de l'étincelle par rapport aux fibres musculaires.

Protocol

Une. Mise en place osmotique stress système de perfusion La figure 1 est un protocole schématique de calcium évaluation des étincelles dans les fibres musculaires squelettiques intacts. Mettre en place un micromanipulateur à trois axes (XYZ), apte à positionner l'extrémité de sortie du système de perfusion contenant au moins deux canaux. Cela pourrait être fait avec jetable canon seringue Luer-joint avec trois – façon Luer – Lok ro…

Representative Results

Des études antérieures ont montré que le stress hypoosmotique transitoire induite Ca périphérique 2 + étincelles à proximité de la membrane du sarcolemme dans les fibres musculaires intactes 11. Figure 1 montre les images de intactes fibres musculaires individuelles avec membrane sarcolemme lisse et stries claires caractéristiques. Figure 2 montre typique Ca 2 + étincelles (comme des images xy) ont été induites par transitoire (100 s…

Discussion

Cette méthode d'évaluation de Ca ^{2 +} des étincelles dans le muscle squelettique intact est un outil utile pour la physiologie du muscle et de la recherche de la maladie. Nous avons montré que la réaction de Ca ^{2 +} de la bougie a été modifiée dans des conditions différentes, y compris la dystrophie musculaire de ^11, le vieillissement de ^{_18, 19,} ainsi que dans la sclérose latérale amyotrophique ^20. Notre étude récente a également révélé…

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation