교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가
Summary
우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다.
Abstract
염증의 사이트에 주변에서 면역 세포의 모집은 점막 표면에서의 선천성 면역 반응에 필수적인 단계입니다. 방광의 감염시, 다형 핵 백혈구 (PMN, 호중구)는 혈류에서 마이그레이션 및 방광 상피 세포를 통과. 호중구 응답이없는 상태에서 감염을 해결하지 않으면 방광 방어 PMN의 중요성을 보여줍니다. 방광 상피 uropathogenic 대장균 (UPEC)의 정착을 촉진하기 위하여, 요로 감염 (요로 감염)의 대부분의 원인 물질은, 부분적으로 정의 된 다양한 메커니즘을 사용하여 급성 염증 반응을 저해. 추가 호스트 및 세균성 병원체 사이의 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 UPEC에 타고난 면역 반응의 이러한 측면의 체외 모델을 개발했다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석에서, 보이든 챔버의 변형, 배양 방광 epithelial 세포 투과성 지원의 아래쪽에 합류로 성장하고 있습니다. PMN 인간 정맥 혈액으로부터 격리되어 방광 상피 세포층의 측저 측에인가된다. 세균 감염이나 화학 유인 물질 분자에 대한 응답으로 생리학 관련 기저 첨단으로 방향을 나타내는 PMN 마이그레이션은 혈구를 사용하여 열거됩니다. 이 모델은 UPEC 및 진핵 세포 사이의 상호 작용을 조사 할뿐만 아니라 PMN 의해 방광 상피의 순회를위한 분자 요구를 심문하는 데 사용될 수있다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 모델은 방광에 UPEC에 대한 초기 염증 반응에 대한 우리의 이해를 증진 할 것이다.
Introduction
몸 전체 세포의 이동은 종종 긴 거리에 걸쳐, 성장과 발달, 상처 치유 및 면역 반응에 필요합니다. 세포 이동은 복잡하고 신호 폭포와 골격 구성 요소의 재 배열 등 다양한 프로세스의 조정을 필요로한다. 세포는 정의 화학 그라데이션 (화성)으로 무작위로 (chemokinesis)를 이동뿐만 아니라 수 있습니다. 대부분의 기술은 체외에서 세포의 이동을 연구하기 위해 개발되었다. 가장 오래되고 가장 일반적인 방법, 보이든 챔버, 화학 주성 물질이 바닥 챔버와 그 세포에 배치 수직 두 개의 챔버 시스템의 구성은 상단 챔버 (1)에 배치됩니다. 두 개의 챔버를 분리 정의 된 크기의 기공을 가진 투과 필터를 통해 세포의 이동, 감시된다. 그 밖의 기술은 Zigmond 챔버 (2) 및 던 챔버 포함한 세포 이동을 조사하기 위해 개발되었다3. 이러한 집단적인 접근 방식은 다양한 세포 유형의 운동으로 상당한 통찰력을 수득했다.
chemokinesis 및 주 화성의 기본 원리를 질의 이외에,이 챔버 분석법은 세포 외 기질 성분과 모두 내피와 상피 세포층을 통한 세포 이동의 조사를 용이하게했다. 다른 기술을 통해 두 챔버 시스템의 장점은 다공성 멤브레인이 콜라겐 또는 피브리노겐과 같은 단백질로 코팅 될 수 있으며, 세포 외 기질 같은 절연막의 세포 이동이 평가 될 수 있다는 점이다. 또한, 배양 된 세포주 성장 및 투과성 지지체에 차별화 될 수있다. 내피 세포 장벽을 가로 질러 세포의 움직임을 조사하기 위해, 배양 된 내피 세포 투과성 지지체의 상부 리저버에 접종하고 성장시킨다. 이러한 면역 세포와 같은 운동성 세포, EN에 걸쳐 낮은 저수지에 상부 저수지 및 마이그레이션에 추가생리적 정점 – 투 – 기저 방향으로 내피 장벽이 관찰된다. 이 모델은 혈류 중 면역 세포의 혈관 외 유출을 이해하는 귀중한되었습니다. 옮기는 내피 달리 상피 장벽을 가로 질러 세포의 이동은 일반적 측저에서 첨단으로의 방향에서 발생한다. 시험관에 이러한 이벤트를 모델링하기 위하여, 연구자들은 시드 및 투과성 지지체의 아랫면에 배양 된 상피 세포 성장. 운동성 세포 측저에서 첨단으로의 방향을 나타내는 상피 장벽을 가로 질러 상부 리저버와 이주에 첨가되고 모니터링된다. transepithelial 이주의 이러한 모델은 크게 점막 표면에서 염증 반응, 특히 폐의 그와 4,5 창자에 대한 우리의 이해에 기여했다.
반면, 요로 상피 세포를 통해 면역 세포의 인신 매매는 훨씬 적은 관심을 받고있다. 우리 understandi를 더하려면방광 상피 장벽 (6)를 통해 이동, (호중구 PMN) NG uropathogenic 대장균 (UPEC) 감염 중 요로의 선천성 면역 반응, 우리는 다형 핵 백혈구의 조사를 가능하게하는 시험 관내 분석, transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석을 개발 -8. transepithelial 이주의 다른 두 개의 챔버 모델과 마찬가지로, 배양 된 방광 상피 세포 투과성 지원의 밑바닥에 성장과 합류 상피 층을 형성하고 있습니다. 정맥혈로부터 단리 인간 호중구는, 상피 층 측저 측에인가되고, 생리 학적으로 관련 측저에서 첨단으로 방향 상피 전반 마이그레이션 E. 다른 균주 감염에 반응하여 정량화 대장균 또는 화학 유인 물질 분자의 존재. 많은 연구가 추가로 세포 유형의 부재에서, 호중구의 이동에 chemokinesis 및 화성 모두를 집중했다. 이 계정에 감염 동안 방광 상피 세포와 면역 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 걸립니다 transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 유리하다. 이 다루기 쉬운 체외 모델 Uroepithelial에 표면에 면역 반응의 상세한 조사를 허용 할 가능성이있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배양 방광 상피 세포 라인과 갓 고립 된 인간의 PMN을 사용하여, 우리는 transuroepithelial 호중구 이주의 체외 모델을 설립했다. 이 모델은 요로 감염 (UTI) 동안 선천성 면역 반응, 일반적으로 UPEC (9)에 의해 발생하는 매우 흔한 세균 감염의 복잡성을 해부하기 시작있는 수단이되었습니다. 방광이나 방광염의 감염 동안, 방광 루멘 PMN 모집 세균 통관 (10)을 위해 필수적입니다. 염?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 – DK080752 및 P50-DK064540을 부여합니다. 우리는이 분석을 설정하는 그녀의 노력에 대한 J. Loughman 감사합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
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