In vitro traumatisk hjärnskada modeller utvecklas för att reproducera in vivo hjärnan deformation. Stretch-inducerad skada har använts för astrocyter, neuroner, gliaceller, aorta, och hjärnan endotelceller. Dock använder vårt system en blodhjärnbarriären (BBB) modell som har egenskaper som utgör en legitim modell för BBB att etablera en in vitro TBI modell.
På grund av den höga dödligheten incidenten följd av traumatisk hjärnskada (TBI), metoder som skulle göra det möjligt att bättre förstå de underliggande mekanismer som är inblandade i det är användbart för behandling. Det finns både in vivo och in vitro-metoder som finns för detta ändamål. In vivo-modeller kan efterlikna verkliga skallskada som inträffar under TBI. Dock får in vivo tekniker inte utnyttjas för studier på cellfysiologi nivå. Följaktligen, in vitro-metoder är mer fördelaktiga för detta ändamål eftersom de ger lättare tillgång till cellerna och den extracellulära miljön för manipulering.
Vår protokoll presenterar en in vitro modell av TBI med stretch skada i hjärnan mikrovaskulära endotelceller. Den använder tryck som appliceras på de celler odlade i flexibel-formade brunnar. Trycket appliceras lätt kan kontrolleras och kan producera skada som sträcker sig från låg till svår. Den murinahjärnan mikrovaskulära endotelceller (cEND) genereras i vårt laboratorium är en väl lämpad modell för blodhjärnbarriären (BBB) vilket ger en fördel till andra system som använder en liknande teknik. Dessutom, på grund av enkelheten i metoden är experimentella uppställningar lätt dupliceras. Således kan denna modell användas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i TBI hos BBB.
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Omkring 10 miljoner människor drabbas årligen av TBI vilket gör det ett stort hälso-och medicinska problem 1. På grund av detta, har olika in vivo och in vitro modeller av TBI etablerats och utvecklats för att studera dess mekanismer 2,3,4. En bättre förståelse av TBI kan förbättra patientens behandling och minska tillhörande dödlighet, sjuklighet och kostnad.
Många modeller för hjärnskada som utnyttjar både in vivo och in vitro-metoder finns. In vivo-modeller skulle kunna imitera den faktiska händelsen av huvudskada. Men, på grund av komplexiteten av in vivo-situationen, tillgång till vävnaden av intresse blir begränsad 2. För att förstå den fysiologiska svaret hos individuella celler till följd av den tillfogade skadan, är det viktigt att cellerna är isolerade från de systemiska effekter somkan hämma eller förändra deras individuella svar 5. Av denna anledning, cellulära modeller av trauma ge värdefulla fördelar jämfört med djurmodeller eftersom den mekaniska miljön av cellerna kan styras exakt 6.
In vitro-system som använder användningen av mekaniska belastning som celler eller vävnader för att bestämma förändringar som orsakas av sådan metod av skada har utvecklats. Exempelvis har en metod för att studera effekten av mekanisk skada på celler fastställts för astrocyter, neuroner, gliaceller och aortaendotelceller 7,8,9. In vitro trauma modell fastställts för studier av gnagare och människa astrocyternas reaktivitet 10 anställda en tryckregleringsanordning identisk med vad vi använder för vår modell. Samma metod tillämpades för att framkalla skada genom sträckning i mushjärna mikrokärlsbildning endotelceller (bEnd3) 11 och kortikala neuroner 12,13 liksom, cerebral endothelial celler från nyfödda grisar 14. Anordningen deformeras botten av odlingsbrunn varigenom mekanisk stretch skada 10. Det tillfogar skada vid odlade celler genom applicering av lufttryck över cellerna. Detta tryck kan böja membranet på vilket cellerna växer, och därigenom sträcker cellerna. Olika grader av stretch (dvs. "låg," måttlig "eller" allvarlig ") kan uppnås genom att luften varaktighet trycket puls och intensitet därefter. Denna metod för stretch-induced skadan har samband med traumatiska skador in vivo 7. Dessutom , denna metod för skada möjliggör exakt styrning av den extracellulära miljön och kan lätt reproduceras.
Även ett liknande tillvägagångssätt har använts för många andra typer hjärncell inklusive bEnd3, är vår modell av en fördel i att den använder sig av de murina endothelial hjärnan mikrovaskulära celler (cEND) genererasi vårt laboratorium. Denna cellinje är en väl lämpad modell av blodhjärnbarriären (BBB). I kulturer vitro cell används som BBB: modeller bör ha egenskaper som skulle göra det möjligt för dem att fungera som permeabilitet skärmen. Ett viktigt kriterium för en in vitro cell modell för att vara en spåman av BBB permeabilitet är att det borde ha fysiologiskt realistiska cellarkitektur 15. Trots bEnd3 celler uppvisar distinkta spindel-liknande skivepitelcancer morfologi i kultur 16, de uppvisar oregelbundna morfogenetisk beteende in vitro varvid de bildar cysta-liknande håligheter i stället för de vanliga rörkonstruktioner i fibrin geler 17. Dessutom, när cellerna injicerades in i embryonala och nyfödda möss, framkallade de snabbt växande tumörer dödliga till embryonala möss men inte hos nyfödda och unga möss. Det är därför föreslagit att en eller flera processer som styr normal endothelial tillväxt, migration och differentiering har ändrats eller elied i denna cellinje 18. Å andra sidan, morfologisk, immuncytokemiska utvärdering av endotel-och BBB-markör uttryck, bioelektrisk och paracellulär flödesmätningar att visa att vår BBB modell cEND är verkligen en lämplig modell av BBB-19.
Brain endotel in vivo karaktäriseras av en extremt snäv permeabilitet med trans-endothelial elektriskt motstånd (TEER) som sträcker sig från 2000-5000 Qcm 2. För studier av barriär hjärnan mikrovaskulatur egenskaper som läkemedel, bör paracellulär restriktivitet och täthet av cellerna övervägas. I de flesta hjärnans kapillära endotelceller (BCEC), är detta inte bevaras eftersom cellerna uppvisar TEER sträcker 50-100 Qcm 2 20. Den förevigade hjärnan endotelcellinje bEnd3 genererar Teer värden inte är större än 60 Qcm 2 15. I motsats differentiering av cEND celler med medium innehållande minskat serum displayTeer värden mellan 300-500 Qcm 2 19,21.
Hittills in vitro-modeller av stretch skador på odlade hjärnans endotelceller är knappa. Därför kan en in vitro modell för trauma genom stretch skada med odlade hjärnans endotelceller som fungerar som modell för BBB visa sig vara användbart. I detta protokoll, presenterar vi en in vitro-modell som skulle kunna imitera den faktiska inverkan som hjärnceller, speciellt hjärnan mikrovaskulära endotelceller i BBB, mottar under TBI. Den största fördelen med denna modell är att mängden av skada tillämpas på celler såväl som den extracellulära miljön kan enkelt kontrolleras på ett precist sätt möjliggör enkel reproducerbarhet av experimentell uppsättning.
Effekterna av mekanisk skada in vitro har studerats och metoder har fastställts för astrocyter, neuroner, gliaceller och aortaendotelceller 8, 9, 22. Det finns emellertid hittills fortfarande ingen känd in vitro-modell av stretch skada i odlade hjärnans endotelceller. Cellulära modeller av trauma ge värdefulla fördelar jämfört djurmodeller eftersom den mekaniska miljön av cellerna kan styras exakt 6. Därför, en in vitro-modell för trauma genom stretch skada med odlade endotelceller hjärnceller som fungerar som modell av blodhjärnbarriären (BBB) som vad våra protokoll presenterar kan vara till nytta.
Detta protokoll använder cEND celler, en etablerad BBB-modellen i vårt laboratorium. Eftersom BBB uppdelning ofta dokumenterat i TBI patienter och TBI är ofta kopplad till störningar av BBB som kan leda till ödem bildning 23, 24, pres metodenterade här kan specifikt används vid utförande BBB: studier i förhållande till TBI.
I denna modell är det viktigt att ta hand om hur mycket sträckningsgraden skada appliceras till cellerna. I så mycket som cellerna skadas i alla fall, och med vilken mängd tryck appliceras, graden av skada som kan påverka endotelceller skiljer mycket kraftigt från andra celltyper. Aortaendotelceller är mer motståndskraftiga mot sträcka skada än astrocyter eller blandade gliaceller 9. Dessutom reparera de snabbare efter skadan jämfört med andra celltyper. Därför är för hjärnans endotelceller, särskilt cEND celler, större mängd stretch skada behövs för att producera en hög grad av skada. Man skulle kunna uppnå den önskade graden av skada genom att tillämpa motsvarande tryck som anges i tabell 1. För cEND celler emellertid allvarlig skada föredra på grund av deras motståndskraft mot påfrestningar. LDH genomförda analyserna visadeatt som graden av stretch ökar, mer LDH utsöndras i supematanten. I motsats härtill producerade de celler som fick en låg mängd stretch skada LDH i en mängd liknande med kontrollceller. Som nämndes i protokollet, måste man se till att lämplig mängd medium används eftersom en ökning eller minskning av mängden av mediet kan leda till skillnader i högsta trycket appliceras till brunnarna. Till exempel registrerar en brunn innehållande 5 ml vätska en topp tryck i genomsnitt 4,0 psi medan en tom väl registrerar ett genomsnitt på 3,8 psi då 45 psi tryck appliceras. Därför är det bäst att driva de aktiverande flera gånger över en kontroll väl för att säkerställa att det topptryck som kommer att genereras motsvarar den önskade mängden.
I våra experiment använde vi en viabilitet fläck för att bestämma effekten av sträckning till permeabiliteten av cellmembranet. Optiken i de flexibla-bottnade odlingsplattor vi använde gör att vi kan vi:ew de färgade cellerna direkt under mikroskop. Men när man vill genomföra inmärkning studier direkt efter stretch-skada, kan svårigheter uppstå. Först, kan storleken och tjockleken av plattan utgör ett problem med vissa plattformar mikroskop visning. Andra kan optiken i det flexibla membranet av brunnen vara ett hinder för att rensa visning.
Trots de ovan nämnda begränsningarna, kan emellertid det beskrivna förfarandet användas som en modell för in vitro mekanisk skada av BBB. Traumatisk hjärnskada (TBI) omfattar två komponenter, nämligen, ischemi och trauma. Ischemi kan uppstå som en sekundär skada efter TBI i fall då det råder allvarlig blodförlust leder till lågt blodtryck eller som en följd av svullnad av hjärnan begränsar syretillförseln till hjärnan. Det anses som en försenad, icke-mekanisk skada som representerar rad patologiska processer som har inletts vid tidpunkten för skadan 25. Förekomsten av hypoxi enfter svår traumatisk hjärnskada är vanlig 26. Syre glukos deprivation (OGD) är den metod som för tillfället används för att modellera ischemi in vitro. Således kan utsätta celler för att OGD som en sekundär förolämpning till cellerna efter stretch efterlikna incidensen av TBI följt av ischemi. Därför, för att förbättra vår nuvarande in vitro modell av TBI och mönster så nära som möjligt till en faktisk TBI eftersom det sker in vivo, i framtiden kommer vi också anställa OGD i kombination med stretch skada.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) under licensnummer FO 315/4- och Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr HEALTH-F2-2009 till 241.778 till CF.
Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html | ||
Name of Materials | Company | Catalog Number | Remarks | |
Bioflex Culture Plate – Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF – 3001C | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | ||
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) | |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C | |
MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C | |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | ||
Nonessential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C | |
Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | ||
Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C | |
Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light | |
Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |