ऐसे जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) के रूप में डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) रास्ते दोनों ट्रिगर द्वारा माउस Preimplantation भ्रूण के जीनोम को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन अग्रिमों सटीक आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों की तेजी पीढ़ी सक्षम.
साइट विशेष जीनोम संशोधनों (पीटा, तोड़े में) ले जाने ट्रांसजेनिक चूहों जटिल जैविक प्रणालियों विदारक के लिए और साथ ही मानव रोगों मॉडलिंग और चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं. ऐसे जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), और क्लस्टर नियमित interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / के लिए CRISPR जुड़े (कैस) 9 सिस्टम साइट के रूप में डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के उपयोग में हाल के अग्रिमों विशिष्ट जीनोम इंजीनियरिंग भ्रूण स्टेम (ते) सेल प्रौद्योगिकी पर भरोसा करने के लिए आवश्यकता के बिना वास्तव में किसी भी प्रयोगशाला प्रजातियों में तेजी से लक्षित जीनोम संशोधन प्रदर्शन करने की संभावना खुला. एक जीनोम संपादन प्रयोग आम तौर पर अन्वेषक से परिभाषित जीनोमिक ठिकाना करने nuclease गतिविधि निर्देशित करने के लिए कस्टम डीएनए बाध्यकारी डोमेन के निर्माण द्वारा पीछा ब्याज की एक जीन के भीतर डिजाइनर nuclease लक्ष्य साइटों की पहचान के साथ शुरू होता है. डिजाइनर nuclease plasmids विट्रो में हैं </ उन्हें> निषेचित माउस oocytes के microinjection के लिए mRNA उत्पन्न करने के लिए लिखित. यहाँ, हम निषेचित माउस oocytes में talen mRNA की प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा लक्षित जीनोम संशोधन को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
चूहों ट्रांसजेनिक पशु मॉडल पैदा करने के लिए अब तक के सबसे लोकप्रिय मंच से कर रहे हैं. माउस भ्रूण 1-3 की जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए बहुमुखी उपकरण बॉक्स हाल ही में, जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFN) के रूप में डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ पर आधारित जीनोम संपादन दृष्टिकोण से 4-6, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (talen) 7,8 बढ़ा दिया गया है और क्लस्टर नियमित interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CRISPR जुड़े (कैस) 9 प्रणाली 9. ZFN और प्रत्येक FokI endonuclease 10-12 के लिए मिलकर कर रहे हैं कि (क्रमशः जस्ता उंगली प्रोटीन की सरणियों और दोहराने चर डि अवशेष (RVDS),) दो कस्टम डिजाइन प्रोटीन आधारित डीएनए बाध्यकारी डोमेन के जोड़े के रूप में talen समारोह. इसके विपरीत, Cas9 की मध्यस्थता डीएनए दरार की विशिष्टता (यह भी एक एकल कैमेरिक शाही सेना अणु करार दिया गाइड शाही सेना में जोड़ा जा सकता है जो crRNA और tracrRNA,) CRISPR RNAs transactivating द्वारा प्रदान की जाती है के साथ एक जटिल में है कि अधिनियम 11CRISPR प्रोटीन.
RVDS की एक परिभाषित अनुक्रम के साथ TALENS तेजी से 13-17 चुनने के लिए विधानसभा की रणनीतियों की एक भीड़ के साथ व्यक्तिगत प्रयोगकर्ताओं द्वारा निर्माण किया जा सकता है. CRISPR/Cas9 हालांकि गाइड शाही सेना डीएनए की विशिष्टता अभी भी पूरी तरह से 18,19 हल नहीं है, बंधन, डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ की भी कम श्रम प्रधान पीढ़ी का वादा किया. कस्टम ZFNs की पीढ़ी अब तक विशेष शैक्षिक प्रयोगशालाओं के लिए और इस तरह के Sangamo बायोसाइंसेज और सिग्मा CompoZr सेवा के रूप में वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं के लिए सीमित कर दिया गया है.
सामान्य में, डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के साथ संपादन जीनोम बाद में शामिल होने nonhomologous अंत (NHEJ) या मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) डीएनए की मरम्मत मशीनरी 10,12 आकर्षित जो परिभाषित जीनोमिक loci, पर डबल भूग्रस्त टूटता (डीएसबी) शुरू करने के लिए करना है. एक डीएसबी के NHEJ की मध्यस्थता मरम्मत अक्सर मरम्मत की साइट के पास सम्मिलन और विलोपन की शुरूआत में यह परिणाम है. इस प्रकार NHEJ मरम्मत गएक जीन प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम 4,7,9 के भीतर एक फ्रेम पारी उत्परिवर्तन शुरू करने से एक लक्ष्य जीन के समारोह में दस्तक के लिए शोषण किया जा. वैकल्पिक रूप से, परिभाषित अलावा या आनुवांशिक जानकारी के प्रतिस्थापन डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के साथ मिलकर एक डीएनए दाता प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है. एक डीएनए दाता इस प्रकार मानव संसाधन द्वारा डीएसबी की मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवारत, लक्ष्य ठिकाना साथ अनुरूपता के क्षेत्रों से घिरे अन्वेषक से डिजाइन डीएनए अनुक्रम शामिल हैं. Plasmids 5,6,20 और एकल असहाय oligonucleotides 8,9,21 दोनों को सफलतापूर्वक दाताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया है. NHEJ और न ही ऑफिस की मध्यस्थता जीनोम संपादन न तो समग्र आनुवंशिक संरचना के बिना परेशान nucleotide अनुक्रम में छोटे परिवर्तन बनाने के लिए इन रणनीतियों विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है जो माउस भ्रूण के जीनोम में एक चयन मार्कर की शुरूआत की आवश्यकता होती है.
इस प्रोटोकॉल में हम में जीनोम संपादन के लिए सभी आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णनTALENS का उपयोग माउस भ्रूण. ये एक talen लक्ष्य साइट 22 में से 1) पहचान शामिल है, गोल्डन गेट क्लोनिंग 13 से TALENS के 2) निर्माण, talen mRNA, निषेचित माउस oocytes, भ्रूण स्थानांतरण के लिए 5) शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में talen mRNA की 4) microinjection की 3) इन विट्रो संश्लेषण , और 6) के संस्थापक पशुओं में talen प्रेरित mutagenesis का विश्लेषण. हम talen mRNA microinjection और NHEJ प्रेरित सम्मिलन / विलोपन के लिए संस्थापकों की स्क्रीनिंग पर ध्यान केंद्रित. इस उद्देश्य के लिए हम plasmids के रूप में और माउस भ्रूण में microinjection के लिए talen mRNA की इन विट्रो संश्लेषण में ट्रांसफ़ेक्ट जब स्तनधारी कोशिकाओं में दोनों अभिव्यक्ति की अनुमति है कि bifunctional talen निर्माणों उत्पन्न किया है. इन निर्माणों heterodimeric FokI से जुड़े हुए एक छोटा कहानी रीढ़ 23 स्तनधारी कोशिकाओं में इष्टतम जीनोम संपादन के लिए 24,25 डोमेन शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल भी अन्य डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के microinjection के लिए या डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के संयुक्त इंजेक्शन के लिए अपनाया जा सकता हैऔर दाता निर्माणों (डीएनए दाताओं की डिजाइन WEFERS एट अल. 26,27 से उत्कृष्ट तकनीकी प्रकाशनों में वर्णित किया गया है).
एथिकल विवरण
सभी पशु प्रयोगों केंटन ज्यूरिख के केंटन पशु चिकित्सा कार्यालय के दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
डिजाइनर nuclease संचालित जीनोम संपादन दृष्टिकोण काफी उनके संबंधित जीनोम 10,12 के लक्षित संशोधन करने के लिए उत्तरदायी प्रजातियों की सीमा बढ़ा दिया है. चूहों में जीन को लक्षित ES कोशिकाओं में दो दशक से अधिक के लिए एक मानक तकनीक से किया गया है; चूहे ES कोशिकाओं में कुछ हाल ही में सफलता हुई है हालांकि, हालांकि यह माउस के अलावा अन्य प्रजातियों से ES कोशिकाओं के लिए अनुकूल करने के लिए मुश्किल साबित हो गया है. यहां तक कि ऐसे EUCOMM, KOMP, या ZFN और talen उच्च परिशुद्धता और हो सकता है कि संशोधनों के स्पेक्ट्रम के संबंध में लचीलापन प्रदान करता द्वारा NorCOMM 3 जीनोम संपादन के रूप में भागीदारी द्वारा प्रदान "बंद-the-शेल्फ" जीन लक्षित माउस ES सेल क्लोन की उपलब्धता के साथ माउस जीनोम में पेश किया. Nuclease की मध्यस्थता म्यूटेशनों ले संस्थापक जानवरों हमेशा ES कोशिकाओं के ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन से होने वाले काइमेरा के लिए ऐसा नहीं है जो अत्यधिक रोगाणु लाइन सक्षम 4-6,20,21, होने लगते हैं. इस प्रकार, देस के कुछ मामलों microinjection मेंigner न्युक्लिअसिज़ लक्षित जीनोम संशोधनों के साथ उपन्यास माउस लाइनों का काफी तेजी से पीढ़ी में परिणाम कर सकते हैं.
ZFN और talen के इंजेक्शन से पीटा चूहों की सफल पीढ़ी इंजेक्शन nuclease जोड़ी की गतिविधि पर काफी हद तक निर्भर करता है. TALENS जीवों की संख्या में जीन की एक विस्तृत श्रृंखला को निशाना बनाने में एक उच्च सफलता दर है दिखाया गया है; हालांकि, हाल के अध्ययनों से Talen बंधनकारी साइटोसिन मेथिलिकरण 30,31 के प्रति संवेदनशील है कि सुझाव है. इस प्रकार, नव सृजित nuclease जोड़े, उदाहरण के लिए TALENS pCAG-T7 वैक्टर में क्लोन, ऐसे एनआईएच 3T3 या न्यूरो के रूप में एक माउस सेल लाइन में transiently ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है कुछ हद तक माउस भ्रूण की chromatin राज्य नकल जो-2A,. इधर, nuclease गतिविधि पूर्व mRNA संश्लेषण और microinjection को धारा 5 में वर्णित के रूप में T7 endonuclease परख या पीसीआर उत्पाद का प्रतिबंध डाइजेस्ट का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है. हम संबंध में ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र का अनुक्रमण की सिफारिशसेल लाइन और microinjection प्रयोगों के लिए इस्तेमाल माउस तनाव ive.
माउस युग्मनजों में, अलग talen या ZFN जोड़े अलग mRNA सांद्रता में बेहतर काम करेगा और इसलिए microinjected nuclease mRNA की इष्टतम काम एकाग्रता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जा सकता है. बहुत अधिक भ्रूण मारक में परिणाम कर सकते हैं, जबकि nuclease जोड़ी पर निर्भर करता है, बहुत कम एक एकाग्रता कोई दरार में परिणाम होगा. Nuclease जोड़ी पर निर्भर करता है, हम 2 एनजी / μl और 200 माइक्रोग्राम / उल रूप में उच्च के रूप में कम के कुल mRNA सांद्रता का उपयोग कर सफलता मिली है. इन प्रभावों सेल संस्कृति और भ्रूण अस्तित्व और लक्ष्य लोकस के संशोधन दर दोनों अनुभव से निर्धारित किए जाने की आवश्यकता के लिए nuclease एकाग्रता इष्टतम में प्रयोगों से भविष्यवाणी करना मुश्किल है.
अत्यधिक सक्रिय ZFN या talen microinjected भ्रूण के एक सेल चरण परे अपने लक्ष्य अनुक्रम फोड़ना और इस तरह mutagenesis के एक के जटिल पैटर्न पैदा कर सकता हैसंस्थापकों में डी mosaicism. हम और 4 अन्य एक एकल संस्थापक (चित्रा 5C) में तीन या अधिक विशिष्ट उत्परिवर्तित alleles मनाया है. इन संस्थापकों में से एक नया माउस लाइन की स्थापना के इस प्रकार, जब वंश ध्यान से पाचन assays के एक अपरिभाषित उत्परिवर्तन मौजूद है ही कि प्रमाण उपलब्ध कराने के बाद से अनुकूल उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए अनुक्रमण द्वारा जांच की जानी चाहिए.
आलोचनाओं में से एक अक्सर ZFN और talen सिस्टम के खिलाफ आवाज उठाई इन न्युक्लिअसिज़ भी लक्ष्य साइटों के लिए इसी तरह के हैं कि जीनोम में कहीं और वर्तमान दृश्यों cleaving करने में सक्षम हैं कि संभावना है. इस तरह के बंद लक्ष्य प्रभाव homodimeric FokI डोमेन का उपयोग जल्दी पीढ़ी अभिकर्मकों के साथ मनाया गया है, और heterodimer निर्माणों बंद लक्ष्य प्रभाव 25 कम करने के लिए डिजाइन किए गए थे. संभावित बंद लक्ष्य साइटों सिलिको 32,33 में कुछ हद तक भविष्यवाणी की है और पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा जांच की जा सकती है. एक स्पष्ट लाभ ओएफ बल्कि सेल लाइनों से चूहों को पैदा करने के लिए ZFNs और TALENS का उपयोग पसंद का एक जंगली प्रकार के तनाव को कई backcrosses प्रदर्शन द्वारा वांछित जीनोम संशोधन करने के लिए लिंक रद्द लक्ष्य म्यूटेशन बंद को हटाने की संभावना है. संस्थापक चूहों की एक बड़ी संख्या, nuclease लक्षित लोकस से उत्पन्न और सिलिको में बंद लक्ष्य की भविष्यवाणी की पीसीआर उत्पादों की अगली पीढ़ी गहरी अनुक्रमण के विश्लेषण के लिए loci पीसीआर उत्पादों की पाचन assays के लिए एक विकल्प के गुणात्मक और मात्रात्मक readout पेश कर सकती है.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सहायता प्रजनन तकनीक ऐसी C57BL/6J या B6D2F1 रूप microinjection प्रयोगों के लिए इस्तेमाल मानक माउस उपभेदों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. ऐसे outbred उपभेदों के रूप में अलग मूल के चूहे, सिद्धांत में जीनोम संपादन दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विशेष अनुसंधान प्रश्नों के लिए एक अधिक उपयुक्त आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रदान हो सकता है. ऐसे superovulation के रूप में सहायता प्रदान की प्रजनन तकनीक का प्रदर्शन predi हो सकता हैउपभेदों 34-36 के एक नंबर के लिए cted लेकिन nuclease microinjection के लिए भ्रूण के लिए पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के क्रम में गैरमानक उपभेदों के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
ZFN और talen इसके अलावा, इस तरह के आरएनए निर्देशित CRISPR/Cas9 प्रणाली 9,37,38 के रूप में नए डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ अब जीनोम संपादन अनुप्रयोगों के लिए पेश किया गया है. Microinjection और यहां वर्णित संस्थापक जानवरों के विश्लेषण के लिए सभी तरीकों में भी CRISPR/Cas9 और जीनोम संपादन के भविष्य के मोड को लागू कर रहे हैं.
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मोनिका Tarnowska, Cornelia अल्ब्रेक्ट, और इवा Skoczylas धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन एसएनएफ Sinergia अनुदान CRSI33-125073 पीपी द्वारा वित्त पोषित किया गया.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |