השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר
Summary
השתלת תאים מייצגת אסטרטגיה לטיפול ניוון רשתית המאופיינת על ידי אובדן פוטורצפטור. כאן אנו מתארים שיטה להעשרת פוטורצפטורים הניתנים להשתלה והשתלתם התת-קרקעית בעכברים בוגרים.
Abstract
ליקוי ראייה ועיוורון עקב אובדן תאי חישת האור של הרשתית, כלומר פוטורצפטורים, מייצגים את הסיבה העיקרית לנכות במדינות המתועשות. החלפת פוטורצפטורים מנוון על ידי השתלת תאים מייצגת אפשרות טיפול אפשרית ביישומים קליניים עתידיים. ואכן, מחקרים פרה-קליניים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים לא בוגרים, מבודדים מהרשתית של עכבר יילודים ביום 4 שלאחר הלידה, יש פוטנציאל להשתלב ברשתית העכבר הבוגרת לאחר השתלת תת-רשתית. תאים תורמים יצרו מורפולוגיה פוטורצפטורית בוגרת הכוללת מקטעים פנימיים וחיצוניים, גוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית, ומסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים. ואכן, דיווחים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים תורמים משתלבים באופן פונקציונלי במעגלים העצביים של עכברים מארחים. עבור יישום קליני עתידי של גישה כזו החלפת תאים, השעיות מטוהרות של התאים של בחירה צריך להיווצר ולהציב בעמדה הנכונה עבור שילוב תקין לתוך העין. להעשרה של מבשרי פוטורצפטור, המיון צריך להיות מבוסס על אנטיגנים ספציפיים משטח התא כדי למנוע שינוי כתב גנטי של תאים תורמים. כאן אנו מראים מיון תאים הקשורים מגנטית (MACS) – העשרה של מבשרי מוט מושתל photoreceptor מבודד מן הרשתית יילודים של עכברי כתב ספציפי photoreceptor מבוסס על סמן פני התא CD73. דגירה עם נוגדנים נגד CD73 ואחריו נוגדנים משניים מצומדים מיקרו חרוזים אפשרו העשרה של מבשרי פוטורצפטור מוט על ידי MACS לכ -90%. בהשוואה cytometry זרימה, MACS יש את היתרון כי זה יכול להיות קל יותר להחיל על תקני GMP וכי כמויות גבוהות של תאים ניתן למיין בתקופות זמן קצר יחסית. הזרקת השעיות תאים מועשרות לחלל התת-קרקעי של עכברים בוגרים מסוג פראי הביאה לשיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בהשוואה למתלי תאים לא ממוינים.
Introduction
חזון הוא אחד החושים העיקריים של בני האדם. פגיעה בתחושה זו ועיוורון הם אחת הסיבות העיקריות לנכות במדינות המתועשות. הסיבה העיקרית לליקוי ראייה או עיוורון היא ניוון רשתית, המאופיינת באובדן תאים פוטורצפטורים, שכן ניתן לראותה בניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה, ניוון חרוט-מוט ותנאים אחרים. נכון להיום, טיפול יעיל כדי לשחזר את הראייה שאבדו אינו זמין. בשנים 2006 ו -2008 שתי מעבדות שונות דיווחו, ללא תלות זו בזו, השתלה מוצלחת של תאי מבשר פוטורצפטור מוט לעכברים מסוג פראי בוגר רשתית1,2. לכן, הנובעים האפשרות של השתלת תא מבשר photoreceptor גם לתוך רשתית מנוונת, להחליף פוטורצפטורים מנוונים ולשחזר את הראייה. אכן, הוכח לאחרונה, כי תאים מבשר פוטורצפטור מושתלים כאלה מעוררים קריטריונים מורפולוגיים של קולטני פוטורצפטורים מסוג פראי בוגרים, כגון מקטעים החיצוניים שפותחו כראוי3, מסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים וגוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית2-4, כמו גם את היכולת להשתלב באופן פונקציונלי במעגלים העצביים המארחים5-7. אחד העקרונות העיקריים של אסטרטגיה זו הוא השימוש ביום שלאחר הלידה 4 (PN 4, PN0 מוגדר כיום לידה) רשתית עכברים צעירים, וכתוצאה מכך תערובת של סוגי תאים שונים להשתלה. על רקע יישום טיפולי בעתיד, תערובת זו צריכה להיות מטוהרת עבור תאים מבשר photoreceptor. CD73 תוארה כסמן פני התא הראשון הספציפי עבור פוטורצפטורים צעירים ברשתית8-10. כאן, אנו מדגימים שיטת טיהור תאים מבשר פוטורצפטור המבוססת על סמן משטח תא זה ועם השימוש בטכניקת מיון התאים המגנטיים (MACS). ל- MACS עשויים להיות יתרונות בהשוואה לטכניקות מיון תאים המופעלות על-ידי פלואורסצנט, עקב זמני מיון מהירים והתאמה קלה יותר לתנאי GMP. אנחנו יכולים להדגים העשרה של ~ 90% ושיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בעת השתלת האוכלוסייה המועשרת לחלל התת-קרקעי ברשתיות מסוג בר למבוגרים. לכן, MACS מבוססי photoreceptor הקדמה העשרת תאים השתלה subretinal, הם טכניקות אמינות ומבטיחות לפיתוח אסטרטגיה טיפולית רגנרטיבית לטיפול ניוון רשתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השתלה תת-קרקעית של תאי מבשר פוטורצפטור מייצגת כלי אמין להשגת שילוב של תאים רגישים לאור אלה ברשתיות מארחות במספרים משמעותיים1,2. זה עשוי לאפשר הקמת טיפול בתא לטיפול במחלות ניווניות ברשתית בעתיד6. אוכלוסיית התורמים של תאים, מבודד כיום PN 4 רטינות, היא תערובת של סוגי תאים שונים, שממנו רק תאים מב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אוהבים להודות לאנאנד סווארופ על שסיפק לעכברי NRL-GFP, יוכן האס על התמיכה הטכנית, וסינדי בוהם ואמלי לסמן על גידול בעלי חיים.
עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – מרכז טיפולים רגנרטיביים דרזדן, תוכנית מענק זרע CRTD, SFB 655, ואת E.V ProRetina. קרן, תוכנית הבוגרים DIGS-BB דרזדן, ואת Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH / BD / 60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
