인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석
Summary
최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.
Abstract
최근 몇 년 동안, 표면 및 신경 전달에 관여 구조적 단백질에 대한 항체는 어린이와 성인자가 면역 CNS 질환에서 검출되었다. 이 항체는 진단과 치료를 안내하는 데 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 환자의 혈청에서 항체의 검출을 개선했습니다. 그들은 다음 형광 색소 – 복합 이차 항체 다음에 희석 한 환자의 혈청으로 배양하는 진핵 세포에서 뇌 항원의 표면 발현을 기반으로합니다. 세탁 후, 바인딩 차 항체는 다음 유동 세포 계측법에 의해 분석된다. 우리 그룹은 안정적으로 특정 신경 전달 물질 수용체에 대한 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 세포 계측법 높은 처리량의 흐름을 개발했다. 이 유동 세포 계측법 방법 곧장 앞으로, 양적, 효율적이며, 많은 환자 코호트 쉽게 짧은 시간으로 측정 될 수 있도록 높은 처리량 샘플러 시스템의 사용을 허용한다. 또한,이 같은 셀 기반말할 간단 중추 신경계 및 말초 신경계 모두에서 많은 다른 항원 표적으로하는 항체를 검출하도록 구성 될 수있다. 추가로 새로운 항체 바이오 마커를 발견하는 것은 신속하고 정확한 진단을 가능하게하고 면역 매개 질환의 치료를 향상시킬 것입니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 중추 신경계 (CNS) 질병의 면역 형태가 확인되었다. 이들 질환과 연관된자가 항체의 존재에 의해 정의되는 것으로 밝혀졌다. 이 항체는 신경 세포의 수용체 나 신경 전달의 1,2에 관련된 시냅스 단백질에 결합한다. 다른 항원은 N-메틸-D-아스파 테이트 수용체 (NMDAR) 3-5, γ-아미노 낙산의 B 수용체 (GABA의 B) 수용체 6, α-아미노 -3 – 히드 록시 -5 – 메틸 -4 -로서, 탐지 된 isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용체 7, 전압 – 문이 칼륨 채널 (VGKC) 관련 단백질 : 류신이 풍부한 신경 교종 활성 단백질 1 (LGL-1) contactin 관련 단백질 2 (capsr2) 8,9, 글루타민산 염 수용체 5,10 , 그리고 도파민 2 수용체 (D2R) 11. 과거에는 (주로 뇌염이라는) 이러한자가 면역 CNS 장애는 종종 진단되지 및 치료했다. 이 소설 항체 바이오 마커, 예를 들어,NMDAR의 항체 또는 D2R 항체는 실질적으로 진단과 인식을 개선하고, 환자에 대한 치료 옵션을 열었습니다. 사실, 면역 요법과 조기 치료가 개선 된 결과 (11, 12)와 연결되어 있습니다.
이러한 효소 결합 면역 분석 (ELISA)과 웨스턴 블롯으로 항체를 검출하는 전통적인 방법은 혈청에있는 항체의 검출에 사용되었다. 그러나, 그들은 쉽게 세포 또는 표면 항원의 인식을 사용하지 않고, 오히려 세포 내 항원으로 면역 반응을 보여줄 수 있습니다. 또한, 신경 전달에 관련된 중요한 단백질의 세포 외 도메인에 결합하는 항체는 병원성 2,3,7,13,14 될 가능성이있다. 따라서, 관련 세포 표면 또는 환자의 세포 항체 표적을 발견 할 수있는 정확하고 민감한 분석의 개발이 가장 중요하다. 필드 금 표준 방법은 소위 "휴대 BA에서, 생균의 사용에 기초SED 분석 ". 이 방법은 또한 포유 동물 세포의 항원의 완전한 cDNA의 서열을 함유하는 벡터의 형질 감염에 의해 네이티브 형태 (대부분 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포)의 표면 항원의 발현을 포함한다. 라이브 nonpermeabilized 세포는 다음 희석 된 환자의 혈청 배양 및 형광 색소 – 복합 항 – 인간 면역 글로불린 (ig으로) 이차 항체에 의해 따른다. 형광의 강도 또는 레벨은 검출되고 결합자가 항체의 수준으로 연관된다. 하나의 항원이 세포에서 과다 발현으로이 기술은 고유합니다. 가장 널리 "판독"을 사용은 면역 세포 화학 4,5,8-10 후 공 초점 현미경 분석하고있다. 그러나, 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 성공적으로 탈수 초성 질환 15 ~ 17 환자에서 항체를 감지하는 데 사용되었다. 특히, 워터스 외. 15은 팬을 사용하여 항체의 검출을 비교셀 기반 현미경으로 다음 분석이나 흐름 등의 항체 검출 기술의 엘 세포 계측법 분석하고, 가장 민감한 정확하고 신뢰할 수있는 방법으로 세포 기반 분석 유동 세포 계측법 보여 주었다. 그것은 조사 의존 정량없고, 방사성 물질의 사용을 포함하지 않는 때문에, 세포 기반 분석법 유세포 유리하다. 이 큰 환자의 코호트는 단시간으로 측정 할 수로서 또한 편리하다.
더 최근에, 우리는 면역 CNS 질환 환자 11 NMDAR 항체 및 D2R 항체를 검출하는 세포 기반 분석 계측법 높은 처리량의 흐름을 최적화했다. 우리 그룹은 최근 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 사용하여 환자의 혈청에서 NMDAR 항체를 발견했습니다. 이러한 NMDAR 항체 – 양성 혈청 기계 공 촛점 현미경을 사용하여 분석하고, 또한 11 개의 긍정적 인 것으로 밝혀졌다. 이 프로토콜은 C의 탐지를위한 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 설명자동 높은 처리량 샘플러를 이용하여 환자의 혈청에서 onformation 민감한 CNS 항체.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문은 높은 처리량 샘플러를 사용하여 특정 세포 표면의 연결 단백질을 표적으로하는 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 유동 세포 계측법의 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 면역 CNS 질환으로 영향을 환자의 서브 그룹 NMDAR으로 표면 또는 표면 D2R하는 혈청 항체를 가지고 있음을보고한다.
살아있는 세포 기반 분석법 계측법이 높…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 성 과학 재단 (호주), 뚜렛 증후군 협회 (USA)에 의해 지원되었다, 트리샤 다중 경화증 연구 재단 및 다발성 경화증 연구 호주, 페 트레 재단 (호주), 레베카 L. 장수 의료 연구 재단 (호주). 우리는 모든 환자와 연구에 대한 샘플을 제공하는 가족 구성원을 감사드립니다.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
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