차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델
Summary
표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.
Abstract
조직 문화는 정상적인 발달에서 질병, 세포 기능의 여러 측면을 연구하는 귀중한 도구이다. 종래의 세포 배양 방법은 조직 배양 접시의 고체 기질에 부착하는 액체 매질에 현탁 성장하거나 세포의 능력에 의존한다. 다수의 불멸의 세포 라인은 기본 세포가 생체 성장해야 할 경우에는이 방법이 자주 실패, 생성과 같은 방법을 사용하여 재배하고 있습니다. 이러한 실패는 조직 배양 플라스틱은 세포 성장을위한 표면으로서 사용되는 표준 시스템에서 미세 조직의 적합한 세포 외 기질 성분의 부재에 기인 한 내용. 세포 외 기질은 조직의 미세 환경의 핵심 구성 요소이며 그 존재는 세포 편광, 생존, 증식 등의 생리 기능의 유지 보수를 위해 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 3 차원 조직 배양 방법 차 골수 CEL을 제시LS는 인간의 뼈 (RBM 시스템)의 미세 환경을 요점을 되풀이 공식화 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 재배된다. 세포 외 기질에 포함 된 세포 따라서 기본 조직의 세포 구성을 유지하면서 세포의 생존과 증식이 최대 30 일 동안 지속 할 수있는 종합적인 시스템을 제공, 인간 혈장 보충 매체를 통해 영양소와 함께 제공됩니다. RBM 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 정상 기증자와 환자 아밀로이드증, 각종 혈액 학적 악성 종양에서 차 골수 세포를 성장. RBM 시스템은 새로운 치료제의 전임상 효능의 세포 행동 및 평가의 직접,있는 매트릭스 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 세포로부터 단리 RBM이어서 생체 내 이식, 세포 분류, 유동 세포 계측법, 핵산 및 단백질 분석에 사용될 수있다. 종합적 RBM 방법은 일차 뼈 MARRO의 성장을위한 신뢰성있는 시스템을 제공한다생리 학적 조건에서 W 셀.
Introduction
조직 배양은 본래 유기체에 각종 처리를 비교할 때 전신 변동성을 최소화하기 위해 제어 된 환경에서 세포 행동을 연구하기 위해 개발되었다. 이 방법은 먼저 1900 년대 초 1,2 년에 설립 된 조직 절편이 유리 접시에 생체 전 배양 기술을 언급했다. 1900 년대 중반의 시스템은 오히려 손상 조직의 조각보다 분산 된 세포가 성장하기에 적합하고, 용어 '조직 문화'와 '세포 배양'는 3 동의어가되었다. 이러한 종래의 세포 배양 시스템에서 셀은 다양한 성장 인자로 보충 된 성장 배지와 겹쳐 조직 배양 플라스틱의 표면에 성장된다. 자기편 세포 배양, 세포 부착 및 세포 현탁액에 전파되는 조직 배양 플라스틱 및 비 접착 성 문화에 확산 : 문화의 두 가지 유형의 다양한 세포의 접착 능력을 기준으로 등장했습니다. 셀의 초기부터문화, 다 불멸 세포주는 헬라 4, 제 인간의 암 세포주로 생성되었다. 이들 세포주는 세포 배양 물에서 무기한 증식하는 능력이 있고, 대부분의 생존을 유지하기 위해 특별한 처리를 필요로하지 않는다.
원래의 세포 배양 방법의 환원 주의적 접근 방식은 세포 생존과 증식을 유지하기 위해 필요한 경우에만 최소한의 구성 요소를 포함하여 가능한 한 많은 시스템을 단순화하도록 설계되었습니다. 그러나 단순화 된 세포 배양 방식은 유한 한 수명을 가진 생체 가장 기본 인간의 세포 유형을 지원하기 위해 실패합니다. 따라서, 새로운 문화 시스템은 따라서 세포 외식 생리 조건에서 성장할 수 있도록 최대한 조직의 미세 환경에 근접하도록 설계되고있다. 종래 / 환원 세포 배양 방법, 3 차원 (3-D)과는 대조적으로 배양 시스템은 이제 다양한 효율적 문화 바람직한 방법이되고있다인간의 세포 선 및 일차 전지는 이후에 지원 미세 환경의 맥락에서, 건강과 질병에 관련된 메커니즘을 연구합니다. 이러한 3-D 시스템은 일반적으로 관심의 세포 유형을 연구하는 조직의 미세 환경을 요점을 되풀이하기 위해, 성장 인자 보충 복원 행렬 및 / 또는 매체를 사용하여 설정된다. 이러한 3 차원 (3-D) 배양 모델의 첫번째는 유선 개발을 연구하기 위해 개발되었다. 유방 상피 세포가 리겔에 포함 된 기본 조건, 콜라겐 IV와 세포 외 기질 (ECM)의 라미닌이 풍부한 소스와 세포를 제공하고, 성장 매체와 겹쳐합니다. 이러한 조건 하에서, 유선 상피 세포가 유방 꽈리 닮은 클러스터를 형성하고, lactogenic 호르몬 자극시, 선포 세포는 이러한 꽈리 같은 구조의 중공 lumena으로, 감기 및 다른 우유 단백질을 분비. 카제인 분비도 프로락틴 5 첨가 한 후 표준 문화에서 관찰되지 않았다, 상기 세포의 형태 학적 표현형에 미세 환경을 보존하는 역할을 강조. 세포가 자신의 생리 미시의 문맥 촬영 정상적인 세포 기능의 손실의 또 다른 데모지지 미세하지 않고, 각질 세포가 층상 표피 (6)를 형성하는 데 실패하는 데모입니다. 다른 3-D 모델의 수는 기본 세포의 생체 전파 7,8를 할 수 있도록 만들어졌다.
세포 행동의 미세 환경의 중요한 역할은 우아하게 매트릭스 때 콜라겐 배양 유방 상피 세포가 리겔에 형성 올바르게 편광 선포 세포에 비해, "내부 아웃"선포 세포를 형성 연구에서 입증되었다. 라미닌 생산 근 상피 세포가 콜라겐 I 배양 9에 추가 된 경우에 적절한 형태의이 손실은 복귀했다. 또한, 올바른 미시는 정확한 필요합니다유전자형 표현. 접시에 성장, 세포 – 세포 접착 분자 CEACAM1로 형질 MCF7 유방암 세포는 형질 감염되지 않은 CEACAM 음성 세포와 완전히 동일하게 동작. 그러나, 비 악성 유방 상피 세포 (10)에 설립되었습니다로 CEACAM1로 형질 MCF7 세포는, 중공 lumena와 정상 표현형과 양식을 선포 세포로 복귀하면서 ECM, 야생형 MCF7 양식 종양 같은 구조와 접촉, 리겔에 배양 하였다. 마찬가지로, β1-인테그린 유방암 세포를 차단하면 표준 배양 조건에서 동작을 변경할 수 있지만, 3-D 문화에서 수행 된 동일한 실험은 β1-인테그린을 차단하는 것은 정상적인 표현형 (11)에 악성 세포를 되돌 설명하지 않습니다. 따라서, 미시 조직은 세포 생존을 유지하기 위해 요구되지 않고, 또한 적절한 세포 기능을 유지하기 위해.
셀의 동작은 생리적 조건 하에서 연구 될 수있는 시스템을 제공하는 것 외에도의는, 3-D 문화는 새로운 치료제 8,12,13의 전임상 시험을위한 견고하고 신뢰할 수있는 매체를 작동합니다. 3-D에서 세포를 배양하면 세포 – 세포 및 세포 – ECM 부착의 기여가 평가 될 수있는 환경 매개 약제 내성 (14)의 조건에서 조사 화합물의 검사를 할 수 있습니다. 또한, 새로운 화합물의 오프 대상 독성은 다양한 조직의 여러 세포 구획을 통합하여 확인 될 수 있습니다. 이러한 화면은 더 빠르게 수행하고 비용 효율적인 생체 8 비교 연구보다 될 수있다.
여기에서 우리는 정상 및 악성 골수 (BM) 세포가 밀접하게 인간의 BM의 미세 환경을 흉내 낸 시스템에서 체외 증식 복원 골수 (RBM)의 3-D 모델의 설정을 제시한다. BM 기질의 다양한 구성 요소와 함께 2-D의 문화, 액체 또는 부착 공 배양에 인간의 기본 BM 세포를 성장 이전 시도, 3-D, 반 고체 한천 문화로 인해 조직의 미세 15-18의 구성 요소와 세포를 공급하는 그들의 무능력에 제한된 성공을 만났다. 이러한 시스템에서 기본 BM 세포는별로 가능성이 있고 생체을 증식하는 데 실패했습니다. 인간 BM 전구 세포는 BM 간질 세포와 공 배양 타원체에서 재배되는 다른 시스템은 조혈 줄기 세포 생존 및 증식이 적어도 96 시간 지속 된 19 3-D 시스템이다. 조혈 전구 생물학의 이해에 매우 유용하지만, 그러나,이 시스템은 충실히 그 유용성을 제한, 따라서 ECM 구성 요소의 부재로 인해 BM의 미세 환경을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기에 설명 RBM 모델은 인간의 BM 셀룰러 및 세포 외 구획은 시험 관내에서 재구성되는 포괄적 인 시스템을 제공한다. 우리는 RBM의 문화가, 정상적인 인간의 BM 세포의 체외 성장을 지원할 수있는 쇼로 우리각종 혈액 질환을 가진 환자에서 분리 된 세포와 같은거야.
Protocol
Representative Results
Discussion
RBM 모델은 BM의 세포 조성물을 30 일까지 생체를 유지하는 포괄적 인 시스템을 제공합니다. 자신의 기능이 밀접하게 생체 내에서 발견 된 BM 구조를 흉내에 따라 RBM 자기 충 성장 BM 세포. 더욱이,이 다발성 골수종 클론 (8)의 팽창을 허용 우선 시스템이다. BM 세포의 강력한 성장과 문화의 전반적인 성공을 보장하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1)> 70 %의 생존 능?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강, 국립 암 연구소 (1R21CA141039), BD Biosciences는 연구 그랜트 수상, 암 퍼듀 대학 센터 미국 암 학회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (IRG # 58-006-53)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 연구 및 건강 연구 및 앨버타 암위원회 연구 이니셔티브 프로그램의 캐나다 연구소. MP는 건강의 국립 연구소, 국립 암 연구소, 암 예방 인턴쉽 프로그램에 의해 지원되었다 (R25CA128770, PI : D. Teegarden) 종양학의 과학 센터와 퍼듀 대학에서 발견 학습 연구 센터에 의해 관리.
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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