प्राथमिक मानव अस्थि मज्जा और उसके Malignancies अध्ययन के लिए एक तीन आयामी ऊतक संस्कृति मॉडल
Summary
मानक संस्कृति तरीकों में कोशिकाओं को उनके मनोवैज्ञानिक वातावरण से बाहर ले जाया जाता है और एक पकवान की प्लास्टिक की सतह पर हो. प्राथमिक मानव अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए हम कोशिकाओं ऊतक के मूल निवासी microenvironment recapitulating परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं, जहां एक 3 डी संस्कृति सिस्टम बनाया.
Abstract
टिशू कल्चर सामान्य विकास से बीमारी के लिए, सेल समारोह के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण किया गया है. पारंपरिक सेल संस्कृति तरीकों एक टिशू कल्चर पकवान की एक ठोस बुनियाद को देते हैं या तरल माध्यम में निलंबन में विकसित करने के लिए या तो कोशिकाओं की क्षमता पर भरोसा करते हैं. एकाधिक अमर सेल लाइनों प्राथमिक कोशिकाओं पूर्व vivo बड़े हो जाने की जरूरत है लेकिन, जब इन तरीकों अक्सर विफल, बनाया है और इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग कर विकसित किया गया है. इस तरह की विफलता टिशू कल्चर प्लास्टिक सेल के विकास के लिए एक सतह के रूप में प्रयोग किया जाता है, जहां मानक सिस्टम से ऊतक microenvironment के उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स घटकों के अभाव को जिम्मेदार ठहराया गया है. बाह्य मैट्रिक्स ऊतक microenvironment का एक अभिन्न अंग है और अपनी उपस्थिति में इस तरह के सेल ध्रुवीकरण, अस्तित्व, और प्रसार के रूप में शारीरिक कार्यों के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम एक 3 आयामी टिशू कल्चर विधि जहां प्राथमिक अस्थि मज्जा सीईएल पेशलोकसभा मानव हड्डी (RBM प्रणाली) का microenvironment पुनरावृत्ति करने के लिए तैयार की बाह्य मैट्रिक्स में बड़े हो रहे हैं. बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड, कोशिकाओं इस प्रकार प्राथमिक ऊतक के सेलुलर संरचना को बनाए रखते हुए सेल अस्तित्व और प्रसार करने के लिए 30 दिनों के लिए निरंतर किया जा सकता है, जहां एक व्यापक प्रणाली प्रदान करने, मानव प्लाज्मा के साथ पूरक मध्यम के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जाती है. Rbm सिस्टम का प्रयोग हम सफलतापूर्वक सामान्य दाताओं और रोगियों amyloidosis साथ, और विभिन्न हिमेटोलोजिकल malignancies से प्राथमिक अस्थि मज्जा की कोशिकाओं हो गए हैं. rbm प्रणाली उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के preclinical प्रभावकारिता के सेल व्यवहार और मूल्यांकन की प्रत्यक्ष, में मैट्रिक्स वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, कोशिकाओं rbm से अलग किया और बाद में vivo में प्रत्यारोपण, सेल छँटाई, प्रवाह cytometry, और न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. साथ में ले ली, RBM विधि प्राथमिक हड्डी MARRO के विकास के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करता हैशारीरिक शर्तों के तहत डब्ल्यू कोशिकाओं.
Introduction
टिशू कल्चर बरकरार जीवों में विभिन्न प्रक्रियाओं की तुलना करते समय प्रणालीगत परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण में सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. इस विधि पहली जल्दी 1900 1,2 में स्थापित और ऊतक explants एक गिलास पकवान में पूर्व vivo सुसंस्कृत थे जहां एक तकनीक को संदर्भित करता था. मध्य 1900 के दशक में यह व्यवस्था नहीं बल्कि बरकरार ऊतकों के टुकड़े से छितरी कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुकूलित, और शर्तों 'टिशू कल्चर' और 'सेल कल्चर' 3 पर्याय बन गया था. ऐसे पारंपरिक सेल संस्कृति प्रणालियों में कोशिकाओं विभिन्न वृद्धि कारकों के साथ पूरक मध्यम विकास के साथ मढ़ा टिशू कल्चर प्लास्टिक की सतह पर हो रहे हैं. पक्षपाती सेल संस्कृति, कोशिकाओं देते हैं और कोशिकाओं निलंबन में प्रचारित कर रहे हैं जहां टिशू कल्चर प्लास्टिक और nonadherent संस्कृतियों, पर फैल जहाँ: संस्कृतियों के दो प्रकार के विभिन्न कोशिकाओं के आसंजन क्षमता के आधार पर उभरा है. सेल के शुरुआती दिनों के बाद सेसंस्कृति, कई अमर सेल लाइनों ऐसे हेला 4, पहला मानव कैंसर कोशिका लाइन के रूप में बनाया गया है. ये सेल लाइनों सेल संस्कृति में अनिश्चित काल के लिए पैदा करने के लिए क्षमता है, और सबसे व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कोई विशेष उपचार की आवश्यकता नहीं है.
मूल सेल संस्कृति तरीकों की न्यूनकारी दृष्टिकोण सेल व्यवहार्यता और प्रसार को बनाए रखने के लिए आवश्यक केवल न्यूनतम घटकों को शामिल करके जितना संभव प्रणाली को सरल बनाने के लिए डिजाइन किया गया था. हालांकि, सरलीकृत सेल संस्कृति दृष्टिकोण परिमित जीवन अवधि के साथ पूर्व vivo सबसे प्राथमिक मानव कोशिका प्रकार का समर्थन करने के लिए असफल. इसलिए, नई संस्कृति प्रणालियों इस प्रकार सेल explants शारीरिक शर्तों के तहत विकसित करने की अनुमति, यथासंभव ऊतक microenvironment अनुमान लगाने के लिए तैयार किया जा रहा. पारंपरिक / न्यूनीकारक सेल संस्कृति दृष्टिकोण, 3 आयामी (3 डी) के विपरीत संस्कृति सिस्टम अब विभिन्न कुशलता संस्कृति के लिए एक पसंदीदा तरीका बनता जा रहे हैंमानव कोशिका लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं बाद में एक सहायक microenvironment के संदर्भ में, स्वास्थ्य और रोग में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए. इस तरह 3 डी सिस्टम आमतौर पर ब्याज की सेल प्रकार का अध्ययन करने के लिए ऊतक microenvironment पुनरावृत्ति करने के लिए, वृद्धि कारकों के साथ पूरक खंगाला matrices और / या माध्यम का उपयोग कर स्थापित कर रहे हैं. इन 3 आयामी (3 डी) संस्कृति मॉडल का पहला स्तन ग्रंथि विकास का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. स्तन उपकला कोशिकाओं Matrigel में एम्बेडेड थे देशी शर्तों, कोलेजन चतुर्थ और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के laminin अमीर स्रोत के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते हैं, और मध्यम विकास के साथ मढ़ा है. ऐसी परिस्थितियों के अंतर्गत, स्तन उपकला कोशिकाओं स्तन acini जैसी समूहों का गठन, और दुग्धावण हार्मोन के साथ उत्तेजना पर, इन acini acini संरचनाओं की तरह खोखला lumena में, कैसिइन, और अन्य दूध प्रोटीन स्रावित. कैसिइन स्राव भी प्रोलैक्टिन 5 के बाद इसके अलावा मानक संस्कृतियों में नहीं मनाया गया, आगे कोशिकाओं की रूपात्मक और प्ररूपी विशेषताओं के संरक्षण में microenvironment की भूमिका पर बल. कोशिकाओं को अपनी शारीरिक microenvironment के संदर्भ से बाहर ले जाया जाता है जब सामान्य सेलुलर समारोह के नुकसान का एक और प्रदर्शन सहायक microenvironment के बिना, keratinocytes स्तरीकृत एपिडर्मिस 6 फार्म करने में विफल है कि एक प्रदर्शन है. अन्य 3 डी मॉडल की एक संख्या प्राथमिक कोशिकाओं के पूर्व vivo प्रचार 7,8 अनुमति देने के लिए बनाया गया है.
सेल व्यवहार में microenvironment की महत्वपूर्ण भूमिका सुंदर ढंग से मैं मैट्रिक्स जब कोलेजन में सुसंस्कृत स्तन उपकला कोशिकाओं Matrigel में गठन किया गया है कि सही ढंग से polarized acini की तुलना में, "अंदर बाहर" acini गठन जहां एक अध्ययन में प्रदर्शन किया गया. Laminin उत्पादक myoepithelial कोशिकाओं कोलेजन मैं संस्कृतियों 9 के लिए जोड़ा गया था जब उचित आकारिकी का यह नुकसान लौट रहा था. इसके अलावा, सही microenvironment सटीक के लिए आवश्यक हैजीनोटाइप अभिव्यक्ति. एक थाली में बढ़ी, एक सेल कोशिका आसंजन अणु CEACAM1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट MCF7 स्तन कैंसर की कोशिकाओं untransfected CEACAM नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में बिल्कुल वैसा ही व्यवहार करते हैं. हालांकि, जब nonmalignant स्तन उपकला 10 के साथ स्थापित किया गया है के रूप में CEACAM1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट MCF7 कोशिकाओं, खोखले lumena के साथ एक सामान्य phenotype और फार्म acini पर वापस लौटने जबकि ईसीएम, wildtype MCF7 फॉर्म ट्यूमर जैसी संरचनाओं के साथ संपर्क में, Matrigel में सुसंस्कृत. इसी तरह, β1-integrin स्तन कैंसर की कोशिकाओं में अवरुद्ध मानक संस्कृति परिस्थितियों में उनके व्यवहार को बदलने, लेकिन 3 डी संस्कृतियों में प्रदर्शन ही प्रयोग β1-integrin अवरुद्ध एक सामान्य phenotype 11 को घातक कोशिकाओं में बदल जाती दर्शाता है कि नहीं करता है. इसलिए, ऊतक microenvironment केवल सेल व्यवहार्यता बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यह भी उचित सेल समारोह को बनाए रखने के लिए.
सेल व्यवहार शारीरिक हालत के अधीन अध्ययन किया जा सकता है, जहां एक प्रणाली प्रदान करने के अलावाएस, 3 डी संस्कृतियों उपन्यास चिकित्सा 8,12,13 के preclinical परीक्षण के लिए के रूप में मजबूत और विश्वसनीय मध्यम कार्य करते हैं. 3 डी में संवर्धन कोशिकाओं सेल सेल और सेल ईसीएम आसंजन के योगदान का आकलन किया जा सकता है जहां पर्यावरण की मध्यस्थता दवा प्रतिरोध 14, की शर्तों के तहत investigational यौगिकों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. इसके अलावा, नए यौगिकों के बंद लक्ष्य विषाक्तता विभिन्न ऊतकों के कई सेलुलर डिब्बों को शामिल करके पता लगाया जा सकता है. इस तरह की स्क्रीन और अधिक तेजी से प्रदर्शन और अधिक लागत प्रभावी विवो 8 में तुलनीय पढ़ाई से किया जा सकता है.
यहाँ हम सामान्य और घातक अस्थि मज्जा (बीएम) कोशिकाओं निकट मानव बी.एम. का microenvironment नकल उतार एक प्रणाली में पूर्व vivo पैदा करना जहां खंगाला अस्थि मज्जा (RBM) के एक 3 डी मॉडल की एक सेटअप प्रस्तुत करते हैं. बी.एम. स्ट्रोमा के विभिन्न घटकों के साथ 2 डी संस्कृतियों, तरल या पक्षपाती cocultures में प्राथमिक मानव बी.एम. कोशिकाओं से बढ़ पर पिछले प्रयास, या 3 डी, अर्द्ध ठोस अगर संस्कृतियों की वजह से ऊतक microenvironment 15-18 के घटकों के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति करने में अपनी असमर्थता को सीमित सफलता मिली है. इन पद्धतियों में प्राथमिक बी.एम. कोशिकाओं गरीब व्यवहार्यता था और पूर्व vivo पैदा करना असफल रहा. मानव बी.एम. पूर्वज कोशिकाओं बी.एम. stromal कोशिकाओं के साथ अंडाकार आकृति cocultures में बड़े हो रहे हैं, जहां एक और प्रणाली hematopoietic स्टेम सेल व्यवहार्यता और प्रसार को कम से कम 96 घंटे 19 के लिए निरंतर था जहां एक 3 डी प्रणाली है. Hematopoietic पूर्वज जीव विज्ञान को समझने के लिए अत्यधिक लाभकारी हालांकि, हालांकि, इस प्रणाली ईमानदारी से इसकी उपयोगिता सीमित है, इसलिए, ईसीएम घटकों के अभाव के कारण बी.एम. का microenvironment पुनरावृत्ति नहीं करता है. यहाँ वर्णित rbm मॉडल मानव बी.एम. के दोनों सेलुलर और बाह्य डिब्बों विट्रो में पुनर्निर्मित कर रहे हैं, जहां एक व्यापक प्रणाली प्रस्तुत करता है. हम rbm संस्कृतियों, सामान्य मानव बी.एम. कोशिकाओं के पूर्व vivo विकास का समर्थन कर सकते हैं दिखाने के रूप में हमविभिन्न हिमेटोलोजिकल विकारों के साथ रोगियों से अलग कोशिकाओं के रूप में करूँगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
rbm मॉडल बी.एम. के सेलुलर संरचना करने के लिए 30 दिनों के लिए पूर्व vivo बनाए रखा है, जहां एक व्यापक प्रणाली प्रदान करता है. उनके कार्य को बारीकी से vivo में पाया बी.एम. वास्तुकला की नकल उतार के अनुसार rbm स्वयं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (1R21CA141039), बी.डी. बायोसाइंसेज अनुसंधान अनुदान पुरस्कार, कैंसर के लिए पर्ड्यू विश्वविद्यालय केंद्र के लिए अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान (IRG # 58-006-53) के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया अनुसंधान, और स्वास्थ्य अनुसंधान और अलबर्टा कैंसर बोर्ड अनुसंधान पहल कार्यक्रम की कनाडा के संस्थानों. सांसद के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, कैंसर की रोकथाम इंटर्नशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया (R25CA128770, पीआई: डी. Teegarden) आंकलोजिकल विज्ञान केंद्र और पर्ड्यू विश्वविद्यालय में डिस्कवरी लर्निंग अनुसंधान केंद्र द्वारा प्रशासित.
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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