三维组织培养模型研究人类原发性骨髓和恶性肿瘤
Summary
在标准培养方法细胞被取出来的生理环境，生长在菜的塑料表面。研究原代人骨髓细胞的行为，我们创建了其中细胞条件扼要组织的天然微环境下生长的三维培养系统。
Abstract
组织文化是一个非常宝贵的工具来研究细胞功能的许多方面，从正常发育疾病。常规细胞培养方法依赖于细胞的任一附加到组织培养皿的固体基质或在悬浮液中生长在液体培养基中的能力。多个永生细胞系已经建立和使用这样的方法生长的，然而，当原电池需要被生长的体外这些方法常常失败。这种故障已被归因于缺少从那里组织培养塑料被用作用于细胞生长的表面的标准系统的组织微环境的适当的细胞外基质成分。细胞外基质是组织微环境的一个组成部分，它的存在是对生理功能，如细胞分化，存活和增殖的维持是至关重要的。在这里，我们提出了一个3维的组织培养方法，其中主骨生髓CELLS是生长在细胞外基质配方，概括了人骨（RBM系统）的微环境。嵌在细胞外基质，细胞通过补充了人血浆中的介质供给营养物质，从而提供了一个完整的系统，其中细胞的存活和增殖可以持续长达30天，同时保持了原代组织的细胞组成。使用成果管理系统，我们已经成功地生长正常捐助者和患者的淀粉样变，以及各种血液系统恶性肿瘤原发性骨髓细胞。成果管理系统允许的新型疗法的临床前药效的细胞行为和评价直接在矩阵的实时可视化。此外，细胞可以从RBM中分离，并随后用于体内移植，细胞分选，流式细胞术，以及核酸和蛋白质的分析。综合来看，成果管理方法提供了可靠的系统，用于原发性骨MARRO增长在生理条件下瓦特细胞。
Introduction
组织培养物的开发是为了研究在受控环境中的细胞行为进行比较在完整有机体的各种处理时，以尽量减少系统的可变性。最初成立于1900年初1,2这种方法，指的是一种技术，其中组织外植体离体培养中玻璃盘。在20世纪中期的系统适应于分散生长的细胞，而不是完整的组织碎片，和术语“组织文化”和“细胞培养”成了代名词3。在这种传统的细胞培养系统中的细胞生长的组织培养塑料覆盖以补充有各种生长因子的生长培养基的表面上。贴壁细胞培养物，其中细胞附着和铺展在组织培养塑料和非贴壁培养物，其中细胞增殖的悬浮液：两种培养物都基于不同细胞的粘附能力出现了。由于细胞的初期文化，多永生细胞系已经建立，如海拉4，第一个人类癌症细胞系。这些细胞系有细胞培养增殖下去的能力，也是最不需要任何特殊处理，以保持活力。
的原始细胞的培养方法的还原论方法的目的是要简化系统尽可能地由仅包括维持细胞生存力和增殖所需要的最低限度的部件。然而，简化的细胞培养方法无法支持体外最主要的人体细胞具有有限寿命的类型。因此，新的培养系统被设计为近似的组织微环境尽可能接近，从而使细胞外植体在生理条件下生长。在对比的常规/还原论的细胞培养方法中，3维（3-D）培养系统正在成为一种优选的方法，以有效地培养各人类细胞系和原代细胞随后学习与之相关的健康和疾病的机制，在支持微环境的上下文。这样的3-D系统通常被设置成使用补充有生长因子的重构的矩阵和/或介质，以概括的组织微环境，研究目的细胞类型。第一这些3维（3-D）培养模型的开发是为了研究乳腺发育。提供细胞的天然条件的乳腺上皮细胞包埋在基质胶中，IV型胶原和细胞外基质（ECM）的富含层粘连蛋白来源，并覆盖有生长培养基中。在这样的条件下，乳腺上皮细胞形成簇相似的乳腺腺泡，并且在刺激催乳激素，这些腺泡分泌的酪蛋白，和其它乳蛋白，成腺泡状结构的中空旭光。在标准的文化，甚至除了催乳素5后酪蛋白的分泌没有观察到，进一步强调了微环境中保持细胞的形态学和表型特征的作用。当细胞被取出，它们的生理微环境的上下文中的正常细胞功能的丧失的另一个示范是一个示范，如果不支持的微环境，角化细胞不能形成分层表皮6。已经建立了一些其他的3-D模型，以允许主单元7,8 的体外繁殖。
微环境中的细胞行为的关键作用是优雅的表现在哪里乳腺上皮细胞形成了“由内而外”腺泡胶原蛋白的培养，当我基质相比，形成于基底膜的正确极化腺泡的研究。当层粘连蛋白产生肌上皮细胞被添加到I型胶原培养9这个损失的适当的形态恢复。此外，正确的微环境所需的精确基因型表现。生长在培养皿中，转染的细胞 – 细胞粘附分子CEACAM1 MCF7乳腺癌细胞行为完全一样的未转染CEACAM阴性细胞。然而，当在基质胶中培养的，在ECM中，野生型形式的MCF7肿瘤样结构接触而MCF7细胞转染CEACAM1恢复到正常的表型和腺泡形态与中空旭光，因为已经建立了与非恶性乳腺上皮细胞10。类似地，阻断β1-整合素在乳腺癌细胞中不改变他们的行为的标准培养条件下，但以3-D培养物进行同样的实验表明，阻断β1-整合恢复恶性细胞为正常表型11。因此，组织的微环境，不仅需要维持细胞生存力，也能保持正常的细胞功能。
除了提供其中细胞行为可以在生理条件下被研究的系统秒，3维文化作为强大和可靠的介质的新型疗法8,12,13临床前试验。在3-D培养细胞可研究化合物的筛选环境介导的耐药性14，在细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附的贡献可以评估的条件下进行。此外，新化合物的脱靶毒性可通过将各种组织的多种细胞区室来确定。这样的屏幕可以更快速地进行，且更具成本效益比在体内 8的可比性研究。
这里，我们提出的重构的骨髓（RBM），其中正常和恶性骨髓（BM）细胞增殖的体外系统中的密切模仿人类骨髓微环境的一个3-D模型的设置。先前尝试在二维培养，液体或BM间质中各种成分粘附共培养成长初级人类骨髓细胞，或3-D，半固体琼脂培养获得了有限的成功，因为它们无法提供细胞组织微环境15-18的组成部分。在这些系统中主要的骨髓细胞有活力差，不能增殖体外 。其中人骨髓祖细胞生长在旋转椭圆体的共培养与骨髓基质细胞的另一个系统是其中造血干细胞的活力和增殖的持续时间至少为96小时，19的三维系统。然而，尽管向造血祖生物学的理解非常有益的，这种系统并不忠实地概括了BM的由于微环境是缺乏细胞外基质成分的，因此，限制了其有用性。这里所描述的RBM模型提出了一个全面的系统，人类骨髓细胞和细胞外车厢被重建体外 。我们证明了RBM文化能够支持正常的人骨髓细胞的体外生长，因为我们LL作为细胞治疗各种血液病隔离。
Protocol
Representative Results
Discussion
成果管理模型提供其中的细胞在BM的组合物保持离体长达30天的综合系统。骨髓细胞按其功能密切模仿体内发现的BM架构RBM自分层种植。此外，这是第一个系统，它允许对多发性骨髓瘤克隆8的扩张。为确保BM细胞的生长健壮和培养物的整体成功的最关键的步骤是：1），得到的BM细胞与> 70％生存力和较自由的红血细胞的健康人群，2），以确保基质组分充分混合，使细胞均匀地…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由卫生部，国家癌症研究所（1R21CA141039），BD生物科学的研究资助奖，美国癌症协会的机构研究资助（IRG＃58-006-53），在普渡大学癌症中心的国家研究院的赞助研究，健康研究和阿尔伯塔癌症委员会研究倡议计划的加拿大学院。 MP是由美国国家癌症研究所癌症预防实习计划的国家卫生研究院，支持（R25CA128770; PI：D. Teegarden）的肿瘤学科学中心和发现式学习研究中心在美国普渡大学管理。
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
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