初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル
Summary
標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。
Abstract
組織培養は、通常の開発から病気に、細胞機能の多くの側面を研究するための貴重なツールとなっている。従来の細胞培養方法は、組織培養皿の固体基質に付着したり、液体媒体中で懸濁液中で増殖するいずれかの細胞の能力に依存する。多数の不死化細胞株が作成され、そのようなアプローチを用いて成長させた初代細胞がex vivoで成長させる必要がある場合、しかしながら、これらの方法はしばしば失敗する。このような障害は、組織培養プラスチックは、細胞増殖のための表面として使用される一般的なシステムからの組織の微小環境の適切な細胞外マトリックス成分の不在に起因している。細胞外マトリクスは、組織微小環境の不可欠な構成要素であり、その存在は、細胞の極性化、生存および増殖などの生理的機能の維持のために重要である。ここでは、一次骨髄セル3次元組織培養法を提示lsのは、ヒト骨（RBM系）の微小環境を再現するように処方細胞外マトリックス中で増殖させる。細胞外マトリックス中に埋め込まれ、細胞は、このように一次組織の細胞組成を維持しながら、細胞生存および増殖は、30日まで持続することができる総合的なシステムを提供し、ヒト血漿を補充した培地を介して栄養素が供給される。 RBMシステムを使用して、我々は成功し、正常なドナーや患者アミロイドーシス、および様々な血液悪性腫瘍からの一次骨髄細胞を成長している。 RBMシステムは、直接、イン行列リアルタイム細胞の挙動の可視化と新規治療薬の前臨床効果の評価が可能になります。さらに、細胞は、RBMから単離し、続いてインビボでの移植、細胞選別、フローサイトメトリー、および核酸とタンパク質分析のために使用することができる。一緒になって、RBMの方法は、一次骨marroの成長のために信頼性の高いシステムを提供しています生理的条件下で細胞ワット。
Introduction
組織培養は、無傷の生物において各種の処理を比較するとき、全身の変動を最小限に抑えるために制御された環境における細胞の挙動を研究するために開発された。この方法は、最初に初期の1900年の1,2年に設立され、組織外植片をガラス皿にex vivoで培養した技術を意味した。半ば1900年代では、システムではなく、無傷の組織の断片よりも分散した細胞を増殖するように適合され、用語「組織培養」と「細胞培養」は3の代名詞となった。このような従来の細胞培養系において、細胞は、種々の成長因子を補充した増殖培地を重層した組織培養プラスチックの表面上に成長させる。接着細胞培養、細胞が付着し、細胞を懸濁液中で増殖された組織培養プラスチックおよび非接着性培養物、上に広げ：培養物の2つのタイプが種々の細胞の接着能力に基づいて、浮上している。細胞の初期の頃から培養物は、多数の不死化細胞株は、HeLa細胞4、第一のヒト癌細胞株として、作成されている。これらの細胞株は、細胞培養で無限に増殖する能力を有し、そしてほとんどが生存能力を維持するために特別な処理を必要としない。
元の細胞培養法の還元主義的アプローチは、細胞生存および増殖を維持するのに必要なだけ最低限の成分を含むことによって、可能な限りシステムを簡素化するために設計された。しかし、簡略化された細胞培養アプローチは、有限の寿命を有するex vivoで最も主要なヒト細胞タイプをサポートすることができない。従って、新たな培養系は、したがって、細胞外植片を生理的条件下で増殖させ、可能な限り厳密に組織微小環境に近似するように設計されている。還元主義/従来の細胞培養手法とは対照的に、3次元（3-D）培養システムは、現在、種々の培養を効率的に好適な方法になってきているヒト細胞株および初代細胞は、その後、支持微小環境の文脈において、健康および疾患に関与する機構を研究する。このような3次元システムは、通常、目的の細胞型を研究する組織の微小環境を再現するためには、成長因子を添加し、再構成された行列、および/またはメディアを使用して設定されています。これらの3次元（3-D）培養モデルの第一は、乳腺発達を研究するために開発された。乳腺上皮細胞をマトリゲルに包埋した天然条件下、コラーゲンIVおよび細胞外マトリックス（ECM）のラミニン豊富な供給源を細胞に提供し、成長培地を重層する。このような条件下では、乳房上皮細胞が乳腺腺房に似たクラスターを形成し、乳腺刺激ホルモンによる刺激の際に、これらの腺房は、腺房様構造の中空lumenaに、カゼイン、および他の乳タンパク質を分泌した。カゼイン分泌あってもプロラクチン5の添加後、標準的な培養では観察されなかったさらに、細胞の形態学的および表現型の特徴を維持における微小環境の役割を強調している。細胞は、それらの生理学的微小環境の文脈から取り出される正常な細胞機能の喪失の別のデモでは、支持的微小環境なしに、ケラチノサイトは重層化表皮6を形成するために失敗していることの証明である。他の3-Dモデルの数は、初代細胞のex vivo増殖7,8を可能にするために作成されている。
細胞挙動における微小環境の重要な役割は、エレガントな乳腺上皮細胞は、私が行列コラーゲン中で培養し、マトリゲル内に形成された正確に偏光した腺房と比較した「インサイド·アウト」腺房形成の研究で実証された。ラミニン産筋上皮細胞は、コラーゲンI培養9に追加されたときに適切な形態のこの損失は、元に戻されました。また、正確な微小環境を正確に必要です遺伝子型症状。 CEACAM1は、非トランスフェクトCEACAM陰性細胞とまったく同じように動作し、細胞 – 細胞接着分子でトランスフェクトされた皿、MCF7乳癌細胞で増殖させた。しかし、非悪性乳腺上皮10との間に確立されているようにCEACAM1にトランスフェクトされたMCF7細胞は、中空lumenaの正規表現型および形態腺房に戻りつつECM、野生型MCF7形腫瘍のような構造と接触し、マトリゲルで培養した。同様に、乳癌細胞におけるβ1-インテグリンの遮断は、標準的な培養条件下で、それらの動作を変更したが、3-D培養物で行った同じ実験は、β1-インテグリンの遮断が正常な表現型11に悪性細胞を戻すことを実証しない。したがって、組織微小環境は、細胞生存率を維持するために必要とされるだけでなく、適切な細胞機能を保持する。
細胞の挙動は、生理的条件下で研究することができるシステムを提供することに加えてsは3-D培養物は、新規治療薬8,12,13の前臨床試験のための堅牢で信頼性の高い媒体として機能する。 3-Dで細胞を培養すると、細胞-細胞および細胞-ECM間接着の寄与を評価することができる環境媒介性薬剤耐性14に記載の条件下での治験化合物のスクリーニングを可能にする。さらに、新規化合物のオフターゲット毒性は、種々の組織の複数の細胞区画に組み込むことによって確認することができる。このようなスクリーンは、より迅速に行われ、より費用対効果のインビボ 8 で同等の試験よりもすることができる。
ここでは、正常および悪性の骨髄（BM）細胞が密接にヒトBMの微小環境を模倣するシステムにおいてex vivoで増殖する 、再構成された骨髄（RBM）の3-Dモデルの設定を提示する。 BM間質の様々な構成要素を有する2-D培養物は、液体または接着共培養において初代ヒトBM細胞を増殖する以前の試み、又は3-D、半固体寒天培養物は、組織微小環境15-18の成分を細胞に供給することができないことに限られた成功しか収めていない。これらのシステムでは、一次骨髄細胞は、貧しい人々の生存能力を持っていたし、ex vivoでの増殖することができませんでした。ヒトBM前駆細胞は、BM間質細胞との共培養スフェロイドで増殖させる別のシステムは、造血幹細胞の生存および増殖は、少なくとも96時間持続した19 3-Dシステムである。造血前駆細胞生物学の理解に非常に有益なものの、このシステムは、忠実にその有用性を制限するため、ECM成分が存在しないためBMの微小環境を再現しない。ここで説明するRBMモデルは、人間の骨髄の両方細胞および細胞外区画は、in vitroで再構成され、総合的なシステムを提供します。我々は、RBM培養物は、正常ヒトBM細胞のex vivoでの増殖を支持することができることを示しているとして、我々様々な血液疾患の患者から単離された細胞のようにチェック！
Protocol
Representative Results
Discussion
RBMモデルは、BMの細胞組成物は、最大30日間、ex vivoで維持される総合的なシステムを提供しています。その機能が密接に生体内で見つかったBMアーキテクチャを模倣に従ってRBM自己層別化で成長させた骨髄細胞。さらに、これは多発性骨髄腫クローン8の膨張を可能にする最初のシステムである。 BM細胞の力強い成長と文化の全体的な成功を確保するための最も重要なス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康、国立がん研究所（1R21CA141039）、BDバイオサイエンス研究助成賞、がんパデュー大学センター米国癌協会の制度研究助成（IRG＃58-006-53）、国立研究所からの補助金によって賄われていた研究、健康研究およびアルバータがん会研究イニシアティブプログラムのカナダの協会。 MPは、国立衛生研究所、国立がん研究所、がん予防インターンシッププログラムによってサポートされていました（R25CA128770、PI：D. Teegarden）腫瘍学科学総合研究センターとパデュー大学のディスカバリー·ラーニング研究所で投与。
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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