عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان
Summary
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل مستضد تقديم الخلايا من الغدة الصعترية البشرية عبر مختلف مراحل الهضم الأنزيمي من الأنسجة تليها الكثافة الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة والفرز المغناطيسي و / أو نظام مراقبة الأصول الميدانية أخيرا من السكان خلية من الفائدة.
Abstract
في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الجذعية (DC) والخلايا الظهارية (TEC) من الغدة الصعترية الإنسان. DC وTEC هي الخلية الرئيسية مستضد تقديم (APC) أنواع وجدت في الغدة الصعترية العادي وثبت أيضا أنها تلعب أدوارا متميزة خلال اختيار الغدة الصعترية. يتم ترجمة هذه الخلايا في microenvironments متميزة في الغدة الصعترية، ولكل نوع APC تشكل سوى السكان ضئيلة من الخلايا. لمزيد من فهم بيولوجيا أنواع الخلايا هذه، وتوصيف هؤلاء السكان الخلية هو مرغوب فيه للغاية ولكن نظرا لانخفاض وتيرتها، والعزلة من أي من أنواع الخلايا هذه يتطلب إجراء فعالة وقابلة للتكرار. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة للحصول على خلايا مناسبة لتوصيف الخصائص الخلوية المختلفة. تعطل الأنسجة الغدة الصعترية ميكانيكيا وبعد خطوات مختلفة من الهضم الأنزيمية، وأثرى تعليق الخلية الناتجة باستخدام خطوة الطرد المركزي كثافة Percoll. لعزل العاصمة النخاعي (CD11c و<سوب> +)، وimmunoselected الخلايا من جزء منخفض الكثافة (LDF) عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي. ويتحقق إثراء السكان TEC (MTEC، CTEC) من خلال استنزاف المكونة للدم (CD45 مرحبا) الخلايا من منخفض الكثافة Percoll جزء الخلية السماح العزلة في وقت لاحق عن طريق تنشيط الخلايا مضان الفرز (FACS) باستخدام علامات معينة من الخلايا. عزل الخلايا يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مختلفة.
Introduction
الغدة الصعترية هو الجهاز الذي تحدث التنمية الخلايا التائية. حجمه النسبي والمطلق النقصان مع التقدم في العمر عندما يصبح استبداله تباعا بواسطة الدهون على الرغم من النشاط الغدة الصعترية لا يزال من الممكن الكشف عنها في سن الشيخوخة. وقد تجلى أهميته للاستجابة المناعية في 1960s في وقت مبكر 1.
تتشكل الخلية ذخيرة T من خلال التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية مع المجمعات الببتيد-MHC على أنواع مختلفة من الغدة الصعترية APC، والتي توفر البقاء على قيد الحياة أو الموت العظة لتطوير خلايا T، مما أدى إلى مرجع الخلية التائية وظيفية وإلى حد كبير متسامح النفس 2.
حوالي 98٪ من الخلايا في الغدة الصعترية الإنسان على تطوير خلايا T يشار إلى thymocytes. تتكون النسبة المتبقية 2٪ من عدد من أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك مجموعة متنوعة من TEC (القشرية، النخاع، تحت المحفظة)، والنخاعي بلازماوية العاصمة (حركة التغيير الديمقراطي، الحزب الديمقراطي المسيحي)، الضامة، والخلايا B والخلايا T-إعادة تعميم ناضجة، المحببة، وibroblasts، الخلايا البطانية وخلايا الظهارية نادرة جدا مع النمط الظاهري التعبير التي تشبه الخلايا من الأنسجة الأخرى مثل العضلات، والخلايا العصبية في الجهاز التنفسي وظهارة (الشكل 1). من هذه، وTEC العاصمة هي كبرى أنواع APC جدت في الغدة الصعترية العادية. في السنوات الأخيرة، اكتسبت تنقية هذه الأنواع APC للثقافة والتنميط الجزيئي المزيد والمزيد من الاهتمام. نظرا لانخفاض وتيرتها، والعزلة من أي من أنواع الخلايا هذه لتحليل مفصل يتطلب إجراء كفاءة واستنساخه وفعالة من حيث التكلفة. طريقة المقدمة هنا هو تعديل من الدراسات التي نشرت سابقا 3،4.
كما هو الحال مع أي نوع من الأنسجة الأخرى، واستخراج خلايا من الغدة الصعترية يمكن تحقيقه عن طريق تجزئة إنزيمي في خلية خلية وشبكات التفاعل خلية مصفوفة، من أجل الحصول على تعليق خلايا مفردة. هناك بعض المعلمات مثل كفاءة تفارق جيدة، والغلة الخلية، وبقاء الخلية والاحتفاظ خلية قعلامات urface التي تعتبر حاسمة وتحتاج إلى أن يكون الأمثل لعزل الناجح لهؤلاء السكان الخلية نادرة.
في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ عزل العاصمة ومجموعات فرعية TEC بجعل تعليق خلية واحدة من الأنسجة عن اضطراب الهضم الميكانيكية والأنزيمية. نستخدم كولاجيناز A من نسج كلوستريديوم، الذي يحتوي على نسبة متوازنة من الأنشطة الإنزيمية المختلفة، لتحطيم الكولاجين الأصلية التي تحمل الأنسجة معا. يتم تضمين الدناز أنا في حل انزيم للحد من تجميع الخلايا بسبب الحمض النووي خالية من الخلايا الميتة (thymocytes حساسة للغاية)، ونحن أيضا توفير نهج بديل لعملية الهضم الأنزيمي الأنسجة نموذجية تشمل العلاج الأنسجة الميكانيكية والأنزيمية يساعده dissociator الأنسجة. ثم يتعرض تعليق خلية واحدة إلى واحد Percoll كثافة الطرد المركزي لتخصيب منخفض الكثافة الكسر (LDF) من الخلايا. من هذا جزء من الخلايا، DC يمكن أن تكون معزولة عن طريق تلطيخ وأو علامات DC-السطح (أي CD11c و+) واستخدام الفصل المغناطيسي أو خلية مضان تنشيط الفرز (FACS). على عكس الخلايا اللمفاوية التي تضم الغالبية العظمى من الخلايا في الغدة الصعترية، TEC لا تعبر عن CD45 عند مستويات مرتفعة، ولكنها إيجابية للالتصاق الخلايا الظهارية جزيء EpCAM. CTEC يمكن تمييزها عن TEC النخاع عن طريق التعبير عن مستضد بعد غير معروف معترف بها من قبل مجلس الإنماء والإعمار-2 (القشرية شجيري الخلايا الشبكية-2) الأجسام المضادة 4،5 وأقل إلى حد ما EpCAM التعبير. والفرق المشاركة في التعبير عن EpCAM وCDR2 يسمح العزلة كفاءة هذه الخلايا عبر مجموعات فرعية TEC عالية السرعة الفرز 6.
هو الأمثل لبروتوكول المعروضة هنا لأنسجة الغدة الصعترية الإنسان. مدة الإجراء يعتمد على كمية الأنسجة وقدرة المجرب وكذلك سرعة فارز الخلية، إذا تم استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز. عادة، وبروتوكول لعزل DC يمكن أن تكتمل في غضون 5ساعة -6 وللعزلة TEC في 8-10 ساعة. عزل العاصمة ومجموعات فرعية من أنسجة الغدة الصعترية TEC هو وقت حساس. وكلما زادت سرعة إجراء العزل، وأفضل حالة للخلايا. وأخيرا، فإن خلايا معزولة يمكن استخدامها لمزيد من التحقيقات مثل الدراسات المقارنة مرنا والتعبير البروتين، والتجارب PCR، والبروتين والعزلة، والتنميط الجزيئي (أي transcriptomics، وتحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة)، وكذلك ثقافة الخلية 6.
بيان الأخلاق
من أجل أن تكون قادرة على العمل مع أنسجة الغدة الصعترية الإنسان يحتاج الباحث إلى الحصول على موافقة من لجنة الأخلاق المحلية أو السلطات المسؤولة، فضلا عن موافقة خطية علم المتبرع (أو عادة والديه، حيث عادة ما يتم الحصول على الأنسجة من دون السن القانونية الأطفال). علاوة على ذلك، ينبغي التعامل مع جميع أنسجة الإنسان بأنها ينبغي اتخاذ تدابير قد تكون معدية والمناسبة، مثل العمل مع القفازات، الخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا هو تعديل للبروتوكول الذي نشرته Gotter وآخرون 4. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي حالة والتحضير الأولي للأنسجة وكذلك فصل الكثافة Percoll. ونحن نوصي بشدة لمعالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن بعد جمع. من المهم أن تعمل بسرعة ولكن بدقة عند تنظيف وتقط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للجراحين من وزارة الصدر والقلب والأوعية الدموية وجراحة، جامعة توبنجن عيادة لتزويدنا العينات الغدة الصعترية وبرونو Kyewski (DKFZ، هايدلبرغ، ألمانيا) لتوفير الأجسام المضادة CDR2. نود أيضا أن نشكر هانز يورغ Bühring وسابرينا جريم من مرفق الفرز (جامعة توبنجن). وأيد هذا العمل من قبل SFB 685 ومؤسسة هيرتي.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
