Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.
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Artigo de método
Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson
Neste artigo
Resumo
Resumo
A atividade lipoxygenase (LOX) tem sido implicada em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, mas seus efeitos na patogênese da doença de Parkinson (DP) são menos compreendidos. Modelos de interação gene-ambiente têm utilidade em desmascarar o impacto de vias celulares específicas na toxicidade que podem não ser observadas usando apenas um modelo de doença genética ou toxicante. Para avaliar se isozymes LOX distintos contribuem seletivamente para a neurodegeneração relacionada à DP, os camundongos transgênicos(ou seja, 5-LOX e 12/15-LOX deficientes) podem ser desafiados com uma toxina que imita lesões celulares e morte na doença. Aqui descrevemos o uso de uma neurotoxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP), que produz uma lesão nigrostriatal para elucidar as distintas contribuições de isozimes LOX para neurodegeneração relacionada à DP. O uso de MPTP em camundongos, e primatas não humanos, é bem estabelecido para recapitular o dano nigrostriatal em DP. A extensão da lesão induzida pelo MPTP é medida pela análise hplc da dopamina e seus metabólitos e análise de manchas ocidentais semi-quantitativas de estriato para hidroxilase de tyrosina (TH), a enzima limitante de taxa para a síntese de dopamina. Para avaliar marcadores inflamatórios, que podem demonstrar sensibilidade lox isozyme-seletiva, proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) e imunohistoquímica Iba-1 são realizadas em seções cerebrais contendo nigra substantia, e a análise de manchas ocidentais GFAP é realizada em homogeneados estriais. Esta abordagem experimental pode fornecer novas percepções sobre as interações gene-ambiente subjacentes à degeneração nigrostriatal e DP.
Introdução
O uso de modelos de interação gene-ambiente fornece uma abordagem para imitar fatores de risco que provavelmente influenciam a doença idiopática de Parkinson (DP) e oferece a oportunidade de discernir insights mecanicistas que dificilmente serão elucidados pelo uso de um sistema genético ou toxicantesozinho 1,2. Aqui ilustramos este ponto e descrevemos a aplicação do modelo de camundongos 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) modelo de degeneração nigrostriatal3 para entender melhor a seletividade da atividade de isozínia lipoxygenase (LOX) sobre neuroinflamação e toxicidade4. Embora um papel para isozymes LOX tenha sido am....
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Protocolo
Nota: Todos os procedimentos de animais e métodos de cuidado animal devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da instituição. O estudo descrito aqui foi realizado de acordo com as diretrizes estabelecidas pela IACUC da SRI International.
1. Aquisição e manutenção de camundongos com deficiência de LOX
- Compre ratos deficientes de 5-LOX ou 12/15-LOX deficientes e respectivas cepas e controles combinados com sexo aos 7-8 semanas e permita vários dias para aclimatação à facilidade após a chegada.
- Mantenha os ratos em habitação em g....
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Resultados
Este paradigma de exposição à toxina pode produzir um esgotamento significativo e detectável de dopamina 20% em animais injetados por MPTP vs. soro fisiológico. É importante notar que diferentes lotes de MPTP podem produzir um pouco mais ou menos lesões; assim, para uma melhor precisão, recomenda-se um experimento preliminar em camundongos de tipo selvagem antes do uso em transgênicos quando um novo lote de neurotoxina é utilizado. O uso de lesões leves a moderadas permite observar o impacto do transgene; uma lesão grave.......
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Discussão
O projeto deste estudo de interação gene-ambiente nos permitiu obter novas informações sobre a dupla natureza da isozyme 5-LOX na via nigrostriatal. Ao realizar o HPLC para medir as monoaminas estriais após o tratamento salino ou MPTP em transgênicos sem a isozice de 5-LOX e seus ninhadas de tipo selvagem, pudemos notar que sua deficiência parece ser protetora em condições tóxicas(Figura 1),mas em condições normais, a falta da enzima reduz os níveis de dopamina striatal e pode ser deletério. Assim, podem.......
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Divulgações
Não há nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIGMS 056062.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloridrato de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | para modelagem de DP |
| Solução de formaldeído (paraformaldeído) a 4%, tamponado com fosfato (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | para fixação por imersão Reagente |
| ACS de ácido perclórico, 70% (PCA) | 244252 Sigma-Aldrich | para extração | |
| de ácido HPLCTris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | para homogeneização de tecidos |
| Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | para homogeneização de tecidos |
| Coquetel de inibidores de protease | Sigma-Aldrich | P8340 | para homogeneização de tecidos |
| Coquetel de inibidores de fosfatase | Sigma-Aldrich | P5726 | para homogeneização de tecidos |
| Hidróxido de Sódio (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | para ensaio de proteína Lowry |
| Sacarose, biologia molecular, ≥ 99,5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | para crioproteção |
| Solução salina tamponada com fosfato, pó, pH 7,4 (para PBS 0,01 M) | Sigma-Aldrich | P3813 | para |
| kit de ensaio de proteína IHC BCA | Pierce/Thermo | 23225 | para determinação de proteína |
| Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12 poços | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | para SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Amostra Tampão (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | para SDS-PAGE |
| Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | escada de proteína |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G7126 | para SDS-PAGE |
| Dodecil sulfato de sódio, eletroforese, 98,5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | para SDS-PAGE |
| Álcool Metílico, Anidro, Reagente | American MasterTech Scientific | SPM1057C | metanol para transferência |
| Cloreto de sódio (NaCl), reagente ACS | Sigma-Aldrich | S9888 | solução salina e tampões |
| Leite em pó desnatado Cravo | n/a | para immunoblotting | |
| Solução de Ponceau S em ácido acético a 5% | Sigma-Aldrich | P7170 | para immunoblotting |
| Anti-Tirosina Hidroxilase (TH), ovelha policlonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | para imunofluorescência |
| Anti-tirosina hidroxilase (TH), produtos biológicos policlonais | P40101-0 | Pel-Freez | para immunoblotting |
| Anti-β Actina, coelho | Sigma-Aldrich | A2066 | para imunotransferência de imunotransferência |
| Proteína Ácida Fibrilar Anti-Glial (GFAP), coelho policlonal | Chemicon / Millipore | AB5804 | para imunofluorescência |
| Proteína Ácida Fibrilar Anti-Glial (GFAP), camundongo monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | para immunoblotting |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | para immunoblotting |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugada | Fisher Scientific | 31462 | para imunofluorescência |
| de cabra anti-ovelha, peroxidase conjugada | Pierce / Thermo | 31480 | para imunofluorescência |
| cabra anti-mouse, peroxidase conjugada | Pierce / Thermo | 31430 | para imunofluorescência |
| SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente | Pierce / Thermo | 34078 | para immunoblotting |
| CL-XPosure Filme 7 pol x 9,5 pol | Pierce/Thermo | 34089 | para immunoblotting |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | para immunoblotting |
| Ácido cítrico monohidratado, reagente ACS, ≥ 99,0% | Sigma-Aldrich | C1909 | para IHC |
| Soro de Burro Normal | Millipore | S30-100ML | para IHC |
| Polivinilpirrolidona (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | para |
| Albumina de Soro Bovino IHC (BSA), liofilizado | Sigma-Aldrich | A3294 | para IHC |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | para IHC |
| IgG anti-coelho de burro, Alexa Fluor 568-rotulado | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | para IHC |
| Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | para IHC |
| VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium com DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | para IHC |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | para IHC |
| VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 | para IHC; 10 µ l cada uma das soluções A e B por 1 ml de PBS (de acordo com as instruções) Kit de |
| substrato de peroxidase DAB, 3,3'-diaminobenzidina | Vector Laboratories | SK-4100 | para IHC; por 5 ml de ddH2O, adicione 2 gotas de solução de estoque tampão, 2 gotas de DAB e 1 gota de H2O2 (H2 O2 é adicionado imediatamente antes do uso) |
| Peróxido de hidrogênio, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | para etapa de têmpera em IHC |
| Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | para |
| IHC Cresyl Violet Solution, Força Regular | FD Neurotechnologies | PS102-01 | contracoloração para Iba1 IHC |
| 95% Etanol, álcool reagente | Sigma-Aldrich | R8382 | desidratação para IHC |
| 100% Etanol absoluto | Mallinckrodt | 7019-10 | desidratação para IHC |
| Ácido acético | Sigma-Aldrich | A6283 | descoloração para IHC |
| Xileno | Sigma-Aldrich | 534056 | agente de limpeza para IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | meio de montagem para DAB IHC |
| O.C.T. Composto - Meio de Incorporação de Seção Congelada | EMOCTCS | da American MasterTech Scientific | para corte de criostato |
| Permanganato de potássio | Sigma-Aldrich | 223468 | para descontaminar solução DAB |
| Cloridrato de dopamina | Sigma-Aldrich | H8502 | para HPLC |
| Ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | para HPLC |
| Ácido homovanílico (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | para HPLC |
| Ácido perclórico (PCA) - 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | para HPLC |
| Di-hidrogenofosfato de sódio monohidratado | Sigma-Aldrich | 71504 | para HPLC |
| Ácido cítrico monohidratado | Sigma-Aldrich | C1909 | para HPLC |
| Sal de sódio de ácido 1-octanossulfônico (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | para HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | para HPLC |
| Acetonitrila | EMD | AX0145-1 | para HPLC |
| Água destilada destilada de grau HPLC (ddH2O) | Millipore | para HPLC | |
| 0,22 e micro; m GSTF membrana | Millipore | para filtração | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | inserção de poliestireno com fundo de malha de poliéster, para IHC |
| Disruptor de células ultrassônico (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 coluna de fase reversa | ESA | ||
| (Ultimate 3000) | Amostrador automático de HPLC Dionex | ISO-3100BM | |
| (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Detector eletroquímico | ESA | Coulochem III | |
| Guard Cell | ESA | 5020 | |
| Célula analítica | ESA | 5011A | |
| Software Chromeleon | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | microscópio de luz / fluorescente |
| Gaiola de rato descartável | Ancare | N10HT | |
| Microfiltro superior | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX- camundongos deficientes | O Laboratório Jackson | 004155 | |
| 12/15-LOX-camundongos deficientes | O Laboratório Jackson | 002778 |
Referências
- Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
- Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment intera....
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Reimpressões e permissões
