Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo utilizar el sistema para una amplia gama de aplicaciones.
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Artículo de método
Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform
En este artículo
Resumen
Resumen
Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Esta tecnología ha demostrado su potencial en el tratamiento de las solicitudes previamente difíciles, como son, la entrega de las células primarias inmunes, la reprogramación celular, nanotubos de carbono, y la entrega de puntos cuánticos. Esta plataforma de microfluidos libre de vectores se basa en la rotura mecánica de la membrana celular para facilitar la entrega citosólica del material objetivo. En este documento, se describe el método detallado de uso de estos dispositivos de microfluidos, incluyendo, conjunto de dispositivo, preparación de células, y la operación del sistema. Este enfoque requiere la entrega de un breve optimización del tipo de dispositivo y condiciones de funcionamiento de las aplicaciones antes publicados. Las instrucciones que se proporcionan son generalizables a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega ya que este sistema no requiere tampones especializados o pasos modificación química / de conjugación. Este trabajo también proporcionans de recomendaciones sobre cómo mejorar el rendimiento del dispositivo y localizar averías problemas potenciales relacionados con la obstrucción, la eficiencia de entrega de baja, y la viabilidad celular.
Introducción
La entrega de macromoléculas a la citoplasma de la célula es un paso crítico en aplicaciones terapéuticas y de investigación. Nanopartículas mediada por la entrega, por ejemplo, ha demostrado su potencial en la terapia génica de 1,2, mientras que la entrega de proteínas es un medio prometedor para afectar la función celular en tanto clínicos y de laboratorio 3 4 ajustes. Otros materiales, tales como fármacos de moléculas pequeñas, puntos cuánticos, o nanopartículas de oro, son de interés en aplicaciones que van desde la terapéutica del cáncer 5,6 a 7,8 etiquetado intracelular, y una sola molécula de seguimiento 9.
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Protocolo
1. Almacenamiento
- Guarde los depósitos, soportes, juntas tóricas y los dispositivos de microfluidos en etanol al 70%. Use un recipiente (por ejemplo, frasco o vaso de precipitados) que tiene una tapa para evitar la evaporación y la contaminación por partículas de polvo o fuera. Coloque los dispositivos en un contenedor (1), embalses y juntas tóricas en un segundo recipiente (2), y los titulares en el tercer (3).
Nota: El uso de etanol al 70% para el almacenamiento es para mantener la esterilidad. Si los únicos componentes de la solución son el etanol y el agua (es decir, sin agentes desnaturalizantes), t....
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Resultados
La figura 1 contiene un esquema descriptivo del sistema de suministro de microfluidos. Figuras 2a-b ilustran resultados típicos de tratamiento de las células HeLa con diferentes diseños de dispositivos en la presencia de fluorescencia conjugado 3 kDa de dextrano 20. Si el procedimiento se sigue correctamente, el rendimiento del sistema será sensible al tipo de dispositivo y la velocidad de operación. Por lo tanto, se debe optimizar estas condiciones para una aplicación dada a.......
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Discusión
Pueden necesitar ser optimizado en función del tipo de células y material de suministro del sistema se aplica a ciertos aspectos del procedimiento experimental descrito (es decir, factores distintos de diseño de chips y la velocidad de funcionamiento). La discusión que sigue trata sobre algunos de los factores más comunes a tener en cuenta en el diseño de experimentos.
Para mejorar la señal de entrega de compuestos marcados con fluorescencia, se necesita para hacer frente a las fuen.......
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Divulgaciones
Los autores Armon Sharei, Robert Langer, y Klavs F. Jensen son accionistas de SQZ Biotecnologías Empresa que produce los dispositivos de microfluidos utilizados en este artículo.
Agradecimientos
Damos las gracias a T. Shatova útil para el debate sobre el diseño experimental y análisis de datos. La ayuda y la experiencia de G. Paradis, el personal de la citometría de flujo básico en el Instituto Koch, y el personal del Laboratorio de Tecnología de Microsistemas en el Instituto de Tecnología de Massachusetts Se agradecen. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, y en parte por el Instituto Nacional del Cáncer Centro del Cáncer de Apoyo (Core) Subvenciones P30-CA14051 y MPP-09Call-Langer-60.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Soporte del dispositivo & Depósito de plástico | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Máquina de citometría de flujo utilizada en el Instituto Koch Instalaciones centrales |
| Dispositivo microfluídico | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Sistema de presión para operar dispositivo | SQZ Biotechnologies | Sistema de | |
| presión Pinzas | |||
| Baño |
Referencias
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
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Reimpresiones y permisos
