Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem
Summary
Çözünebilen bir tip 1 kollajen (col1) izolasyonu için geleneksel işlemleri de, uzun inkubasyon tampon ve fibrillerin zahmetli resuspensions of baştan sona yaklaşık 10 gün gerektirmektedir. Burada, biz az 3 saat küçük dermal biyopsilerden Süt1 arındırmak için bir araç açıklar.
Abstract
Çözülebilir kolajen tip 1 (col1) hücre kültürleri için bir yapışkan tabaka olarak ve rejeneratif uygulamalar için hücresel bir yapı iskelesi olarak yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Klinik olarak, bu proteinin yaygın kozmetik cerrahi, dermal enjeksiyonlar, kemik grefti ve rekonstrüktif cerrahi için kullanılır. Bu işlemler için COL1 ve kaynakları inflamasyon ve ret potansiyeli yanı sıra ksenobiyotiksiz hastalık bulaşmasını arttırır, genellikle insan kaynaklı değildir. Bu görüş, verimli ve hızlı bir otolog-türevi dokuların sınırlı miktarlarda ikinci Süt1 saflaştırılması için bir yöntem olup, bu sorunların çoğu aşmak olur, ancak, standart ayırma protokoller uzun ve genellikle kollajen dokularının büyük miktarlarda gerektirir. Burada, en az 3 saat ila yaklaşık 10 gün arasında bu proteinin izole edilmesi ve saflaştırılması için gerekli olan zamanı azaltır etkili bir col1 çıkarma yöntemi göstermektedir. Biz birçok cerrahi işlemler sırasında, çünkü onun durumu bizim doku kaynağı olarak dermis seçti. Tonun yöntemi altderinin, az miktarda yüksek ölçüde saf, çözünebilir Süt1 elde etmek için güçlü çalkalama ve santrifüj filtre ile birlikte geleneksel ekstre etme tamponları kullanır. Kısaca, dermal biyopsiler yağ, bağ dokusu ve saç çıkardıktan sonra buz gibi soğuk dH 2 O iyice yıkanır. Deri örnekleri, 0.5 M sodyum asetat ve yüksek hızlı bir tezgah üstü homojenizörü kullanılarak nonkollagenöz protein ve polisakaritlerin kaldırılır. Artık katı maddelerden kollajen, daha sonra homojenleştirici kullanılarak bir 0.075 M sodyum sitrat tampon maddesi ile ekstre edilir. Bu ekstreler karşılaştırılabilir ya da üstün ticari ürünler için kalite ya da geleneksel prosedürler kullanılarak elde edilmiş olan col1 preparatları elde 100,000 MW kesme santrifüj filtresi kullanılarak saflaştırılır. Bu yöntem, araştırma ve klinik uygulamalarda çok sayıda için otolog kaynaklı COL1 kullanımını kolaylaştıracak tahmin.
Introduction
On yıllardır, araştırmacılar ve ticari satıcılar kullanılabilir düzenlenmiş col1 fibrillerin bir matrisin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ile sonuçlanan nötralizasyonu ardından basit bir asit ekstraksiyon protokolü, bir varyasyonunu kullanılarak deri ve tendon dokusu da dahil olmak üzere bir çeşit kaynaklardan gelen çözündürülmüş Süt1 izole var biyomedikal uygulamalarda 1-4 çok sayıda için. COL1 için klinik uygulamalar birçok örnek olsa da, bu proteinin hazırlık 5-7 gerçekleştirmek için gün veya hafta alarak uzun ekstraksiyonlanm gerektirdiğinden, bu birkaç otolog kaynaklı col1 kullanır. Sonuç olarak, araştırmacılar, araştırma ve hekimler, genellikle, örneğin, sıçan, sığır, domuz veya insan olmayan altderinin gibi dokuları kullanılarak veya kadavra derisi kullanılarak kaldırılır veya sünnet izleyerek hazırlanır COL1 pahalı, ticari preparatları kullanın. Rejeneratif uygulamalar için, yetenekleri ile ilgili olarak bu ürünler, sergi değişkenlik çok katı oluşturulması içinmatrisler veya hücre eki ve büyümeyi destekleme yeteneğine doku yapıları. Sonuç olarak, hızlı erişilebilir ve bol otolog doku kaynaklarından Süt1 ayıklamak için tasarlanmış yeni bir standart yöntem için ayrı bir ihtiyaç vardır.
Bu tür bir yöntem col1 ilgi hayvan modeli çıkarılır ve kollajen bazlı iskeleler üzerine monte tasarlanmış dokuların klinik öncesi test edilmesi için kullanılabilecek bir araştırma ortamında zaman ve paradan tasarruf sağlayacaktır. Aynı zamanda, klinikte bir hızla izole, otolog kaynaklı Süt1 kullanma seçeneğine sahip aksi allojenik veya ksenogeneik hazırlıkları alacak hastalar için genel güvenliği artıracak. Bir autogeneic hazırlık alan hastalar için, bu akıcı yöntem büyük ölçüde biyopsi toplama ve kolajen uygulama arasındaki süreyi azaltacaktır. Bu nedenlerden dolayı, yüksek hızlı ag kullanarak köklü bir col1 izolasyon ve saflaştırma yöntemi geliştirmek için arananrehabilitasyonu amaçlayan ve boyut dışlama santrifüj. Bu yöntem birçok laboratuvarlarda bulunan standart tamponlar ve ekipman kullanarak gerçekleştirmek için basit. Yüksek hızda çalkalama kullanılarak, protokolümüz az 3 saat 8 için yaklaşık 10 gün arasında çözülebilir, dermal Süt1 izole etmek için gerekli olan zamanı azaltır. Önemli olarak, bu metod prosedürleri tek bir kümesi esnasında hastalar için otolog türetilmiş Süt1 hazırlamak için klinik ortamda gerçekleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin önemli bir öğesi, fazla sıvının çıkması için dermal numunenin tekrar etkili sıkıştırma. Bu örnek sıkıştırılmasıyla aşamasında 2,5 mümkün olduğu kadar, sodyum asetatın ayrılması için çok önemlidir. Bu tüpün yanına karşı cildi sıkıştırmak için bir ıspatula ile birlikte, bir tülbent de kullanılabilir, bu tüpten numune çıkarılmasını gerektirir ve bu adımları gerçekleştirmek için gereken süreyi uzatır olsa da. Benzer şekilde, sodyum sitrat hacmi daha son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DBC için HL068915), (CAP) Thrasher Araştırma Fonundan Yeni Araştırmacı Ödülü bir araştırma bursuyla, bir Grant-in-Aid (DBC için 12GRNT11910008) Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen , Çocuk Kalp Vakfı (DBC için), ve Boston Çocuk Hastanesi Kalp İletim Fonu, Ryan Aile Endowment ve David Pullman tarafından yapılan bağışlardan bir araştırma hibe.
Materials
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | – |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. , (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
