भ्रूण अग्रमस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति
Summary
यह वीडियो 10-12 दिनों के अंदर भ्रूण अग्रमस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं की शुद्ध संस्कृति की तैयारी के लिए एक आसान और विश्वसनीय रणनीति को दर्शाता है और मस्तिष्क angiogenesis के कई पहलुओं पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Abstract
भ्रूण मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं angiogenesis और neurovascular विकास और बातचीत के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं. भ्रूण अग्रमस्तिष्क, pial और periventricular के दो संवहनी नेटवर्क, स्थानिक विशिष्ट होते हैं और अलग मूल और विकास पैटर्न है. Pial और periventricular संवहनी नेटवर्क से endothelial कोशिकाओं अद्वितीय जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल और कार्य किया है. यहाँ हम भ्रूण अग्रमस्तिष्क (telencephalon) की periventricular संवहनी नेटवर्क (PVECs) से endothelial कोशिकाओं का शुद्ध आबादी के अलगाव, संस्कृति, और सत्यापन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस दृष्टिकोण में, भ्रूण दिन 15 चूहों से प्राप्त pial झिल्ली से रहित telencephalon, कीमा बनाया हुआ है collagenase / dispase के साथ पचा, और एक एकल कक्ष निलंबन में यंत्रवत् छितरी हुई है. PVECs एक मजबूत चुंबकीय का उपयोग microbeads संयुग्मित anti-CD-31/PECAM-1 एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक चयन का उपयोग सेल निलंबन से शुद्ध कर रहे हैंजुदाई विधि. वे मिला हुआ है और आगे subcultured बनने तक शुद्ध कोशिकाओं endothelial सेल संस्कृति के माध्यम में कोलेजन 1 लेपित संस्कृति व्यंजन पर सुसंस्कृत हैं. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के रूप में PVECs, इस प्रोटोकॉल प्रदर्शनी पत्थर और धुरी आकार phenotypes के साथ प्राप्त की. PVEC संस्कृतियों की पवित्रता endothelial सेल मार्कर के साथ स्थापित किया गया था. हमारे हाथ में, इस विधि मज़बूती से और लगातार PVECs का शुद्ध आबादी पैदावार. इस प्रोटोकॉल, अग्रमस्तिष्क angiogenesis में यंत्रवत अंतर्दृष्टि रहा PVEC बातचीत, और neuronal सेल प्रकार के साथ पार वार्ता को समझने और चिकित्सीय angiogenesis के लिए जबरदस्त क्षमता रखती करने के उद्देश्य से पढ़ाई को फायदा होगा.
Introduction
Angiogenesis, न्यूरोजेनेसिस और neuronal प्रवास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास, मरम्मत और उत्थान में महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं. कई सुरुचिपूर्ण पढ़ाई endothelial कोशिकाओं घुलनशील कारकों की रिहाई के माध्यम से और सीधे संपर्क से neuronal प्रसार और इसके विपरीत प्रोत्साहित दिखाया है. हम यह उत्सुक neuronal progenitors / न्यूरल स्टेम सेल भ्रूण के मस्तिष्क से अलग कर रहे हैं, जबकि इन अध्ययनों में 1-3 के बहुमत में, वे वयस्क मस्तिष्क, अन्य वयस्क ऊतक स्रोतों, या endothelial सेल लाइनों के साथ से endothelial कोशिकाओं के साथ cocultured हो पाया. इस भाग में भ्रूण के मस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं का शुद्ध आबादी अलग और संवर्धन के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों के कारण हो सकता है. हालांकि, angiogenesis, neurogenesis, और neuronal प्रवास सामान्य वयस्क मस्तिष्क में से भ्रूण के मस्तिष्क में और अधिक मजबूत परिमाण के आदेश में होने वाली समवर्ती घटनाओं रहे हैं. embryoni की periventricular संवहनी नेटवर्कसी अग्रमस्तिष्क (telencephalon) बेसल ganglia उत्स के भीतर स्थित एक पोत से निकलती है और भ्रूण दिन 11 (E11) 4,5 द्वारा telencephalon पृष्ठीय को उदर से एक अर्दली ढाल के रूप में विकसित करता है. Periventricular संवहनी नेटवर्क के जहाजों के इस जाल मूल, संरचनात्मक स्थान, विकास पैटर्न, और विकास विनियमन 4,5 पर आधारित pial जहाजों से अलग कर रहे हैं. periventricular angiogenesis ढाल के प्रसार की दिशा telencephalic अनुप्रस्थ neurogenetic ढाल से मेल खाता है. Telencephalon के भीतर, periventricular angiogenesis ढाल और पलायन GABA न्यूरॉन्स की ढाल tangentially के रूप में अच्छी तरह से स्थानिक 6 overlaps. समय के लिए सम्मान के साथ, angiogenesis ढाल के बारे में एक दिन से neurogenetic ढाल और GABA न्यूरॉन ढाल के अग्रिम में है. इस प्रकार, periventricular endothelial कोशिकाओं स्थानिक हैं और अस्थायी अच्छी तरह telencephalic न्यूरोजेनेसिस समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण cues प्रदान करने के लिए तैनात है औरneuronal प्रवास 4,6. इसलिए, neuronal progenitors और / या न्यूरॉन्स के साथ coculture प्रयोगों में भ्रूण periventricular endothelial कोशिकाओं का उपयोग neurovascular अध्ययन बातचीत और neurodegenerative रोग या इस्कीमिक / घाव मस्तिष्क की चोट के इलाज के लिए उपन्यास रास्ते के विकास के लिए एक अधिक अनुकूल मॉडल उपलब्ध कराएगा.
हम उपकला सेल संदूषण सीमित करने के लिए, लेकिन यह भी molecularly और periventricular संवहनी नेटवर्क 4,6 (pial ईसीएस से अलग करने के लिए कहा जाता PVECs) के endothelial कोशिकाओं से कार्यात्मक अलग कर रहे हैं जो pial endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए न केवल, pial झिल्ली को दूर करने के महत्व पर जोर . यहाँ, हम हम नियमित PVECs के एक अमीर और शुद्ध उपज प्राप्त करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में उपयोग करने वाले विधि का वर्णन. ये endothelial कोशिकाओं एक ही समय गर्भवती माउस से अलग भ्रूण forebrains से तैयार कर रहे हैं. वे भविष्य में उपयोग के लिए सफलतापूर्वक विस्तार subcultured, और नीचे जमे हुए किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC के अधिक physiologically प्रासंगिक neurovascular बातचीत पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए अन्य ऊतक स्रोतों से वयस्क मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और ईसी की तुलना में कर रहे हैं और यह भी चिकित्सीय क्षमता है. PVEC तैयारी के लिए यह मृ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक प्रकार का पागलपन पर अनुसंधान के लिए नेशनल एलायंस और अवसाद (NARSAD) युवा अन्वेषक पुरस्कार और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान ए वी के लिए R01NS073635 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
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