Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan
Summary
Denna video visar en enkel och tillförlitlig strategi för beredning av rena kulturer av endotelceller från embryonala framhjärnan inom 10-12 dagar och kommer att vara användbart för forskning fokuserad på många aspekter av cerebral angiogenes.
Abstract
Embryonala hjärnans endotelceller kan fungera som ett viktigt verktyg i studier av angiogenes och neurovaskulära utveckling och interaktioner. De två vaskulära nätverk av embryonala framhjärnan, pial och periventrikulär, är rumsligt distinkt och har olika ursprung och tillväxtmönster. Endotelceller från pial och periventrikulära vaskulära nätverk har unika genuttryck profiler och funktioner. Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll för isolering, kultur, och verifiering av rena populationer av endotelceller från periventrikulär vaskulära nätverket (PVECs) hos embryonal framhjärna (telencefalon). I detta tillvägagångssätt är telencefalon saknar pial membran erhölls från embryonala dag 15-möss hackats, spjälkades med kollagenas / dispas och dispergerades mekaniskt till en enkelcellsuspension. PVECs renas från cellsuspension med användning av positiv selektering med anti-CD-31/PECAM-1 antikropp konjugerad till mikrokulor med hjälp av ett starkt magnetfältseparationsmetod. Renat celler odlas på kollagen 1 belagda kultur rätter i endotelceller kulturmedium tills de blir sammanflytande och ytterligare subkultur. PVECs erhålls med detta protokoll uppvisar kullersten och spindelformade fenotyper, som visualiseras genom faskontrast ljusmikroskopi och fluorescensmikroskopi. Renhet av PVEC kulturer etablerades med endoteliala cellmarkörer. I våra händer, är denna metod ett tillförlitligt och konsekvent ger rena populationer av PVECs. Detta protokoll kommer att gynna studier som syftar till att få mekanistiska insikter i framhjärnan angiogenes, förstå PVEC växelverkan och kors samtal med neuronala celltyper och har enorm potential för terapeutisk angiogenes.
Introduction
Angiogenes, nybildning av nervceller och neuronala migration är kritiska händelser i centrala nervsystemet (CNS) utveckling, reparation och förnyelse. Flera eleganta studier har visat att endotelceller stimulera neuronal proliferation och vice versa genom frisättning av lösliga faktorer och genom direkt kontakt. Vi fann det märkligt att i majoriteten av dessa studier 1-3, medan neuronala stamceller / neurala stamceller isoleras från den embryonala hjärnan, de samodlades med endotelceller från den vuxna hjärnan, andra vuxna vävnadskällor, eller med endothelial cell-linjer. Detta kan delvis bero på de tekniska svårigheterna med att isolera och odling rena populationer av endotelceller från den embryonala hjärnan. Men angiogenes, nybildning av nervceller, och neuronal migration är samtidiga händelser som inträffar i storleksordningar mer robust i den embryonala hjärnan än i normala vuxna hjärnan. Den periventrikulär vaskulära nätverket av embryonic framhjärnan (telencefalon) kommer från ett fartyg som ligger i de basala ganglierna primordium och utvecklas i form av en ordnad gradient från ventrala till bröst-telencefalon från embryonala dag 11 (E11) 4,5. Denna plexus av kärlen i periventrikulär vaskulära nätverket skiljer sig från pial fartyg baserat på ursprung, anatomisk lokalisation, tillväxtmönster och utvecklings reglering 4,5. Utbredningsriktningen för periventrikulär angiogenes lutning matchar telencephalic tvärgående neurogenetiska lutning. Inom telencephalon, överlappar den periventrikulär angiogenes gradienten och gradienten av GABA nervceller migrerar tangentiellt spatialt samt 6. Med avseende på timing, är angiogenes-gradient i förskott av neurogenetiska gradienten och GABA-neuron-gradient av omkring en dag. Således periventrikulära endotelceller är rumsligt och tidsmässigt väl positionerat för att ge viktiga ledtrådar för att stödja telencephalic neurogenes ochneuronal migration 4,6. Därför skulle användning av embryonala periventrikulära endotelceller i samodling experiment med neuronala stamceller och / eller nervceller ger en mer gynnsam modell för att studera neurovaskulära interaktioner och utveckla nya vägar för behandling av neurodegenerativa sjukdomar eller ischemisk / traumatisk hjärnskada.
Vi betonar vikten av att ta bort den pial membran, inte bara för att begränsa epitelial cellerna kontamineras, utan också för att separera pial endotelceller som är molekylärt och funktionellt distinkt från endotelceller i periventrikulär vaskulära nätverket 4,6 (kallas PVECs att skilja från pial EC) . Här beskriver vi den metod som vi rutinmässigt använder i vårt laboratorium för att få en rik och ren avkastning PVECs. Dessa endotelceller är beredda från embryonala framhjärnorna isolerat från en enda tidsinställd-gravid mus. De kan utökas, subkultiveras, och fryses ned med framgång för framtida bruk.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC: s är mer fysiologiskt relevant än vuxna hjärnans endotelceller och EC från andra källor vävnad för studier som fokuserar på neurovaskulära interaktioner och även har terapeutisk potential. För PVEC förberedelser, är det kritiskt början med dissektion att arbeta snabbt för att uppnå en god lönsamhet sedan döda celler kan binda ospecifikt till CD31 mikrokulor. Dessutom, om encelliga fjädring inte uppnås före den magnetiska steg märkning, kommer detta att resultera i felsökning eftersom cellklu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en National Alliance för forskning om schizofreni och depression (NARSAD) Young Investigator Award och National Institutes of Health bevilja R01NS073635 till AV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
