<em> Xenopus</emFluorometry साथ> Oocyte कट खुला वैसलीन गैप वोल्टेज दबाना तकनीक

Summary

कट खुला वैसलीन खाई दृष्टिकोण तेज चैनल कैनेटीक्स के उच्च संकल्प के साथ Xenopus oocytes में व्यक्त वोल्टेज पर निर्भर आयन चैनल से आयनिक और gating धाराओं के कम शोर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मामूली संशोधन के साथ, वोल्टेज दबाना fluorometry कट खुला oocyte प्रोटोकॉल के लिए युग्मित किया जा सकता है.

Abstract

कट खुला oocyte वैसलीन अंतराल (COVG) वोल्टेज दबाना तकनीक oocytes में heterologous आयन चैनल के electrophysiological और गतिज गुणों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. कट खुले सेटअप से रिकॉर्डिंग कम परिमाण gating धाराओं, तेजी आयनिक वर्तमान सक्रियण, और क्रियाशीलता छोड़ना हल करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना (TEVC) तकनीक से अधिक मुख्य लाभ में वृद्धि हुई दबाना गति में सुधार के संकेत से शोर अनुपात, और intracellular और बाह्य परिवेश मिलाना करने की क्षमता शामिल है.

यहाँ, हम कट खुले सेटअप और प्रोटोकॉल के साथ ही वोल्टेज दबाना fluorometry क्षमता जोड़ने के लिए आवश्यक हैं कि संशोधनों को प्रदर्शित करने के लिए, (हंै _वी 1.5), Xenopus oocytes में व्यक्त मानव हृदय सोडियम चैनल को रोजगार.

ऐसे हंै _वी 1.5 के रूप में तेजी से सक्रिय आयन चैनल, गुण, पूरी तरह से जो में, TEVC का उपयोग कर कमरे के तापमान के पास हल नहीं किया जा सकता हैoocyte झिल्ली के घंटे संपूर्णता वोल्टेज नियंत्रण मुश्किल बना clamped है. हालांकि, कट खुला तकनीक में, कोशिका झिल्ली के केवल एक छोटे से हिस्से के अलगाव पैच दबाना तकनीक के साथ जुड़े चैनल चलाने के नीचे रोकने जबकि सही उपवास कैनेटीक्स रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक तेजी से clamping के लिए अनुमति देता है.

COVG तकनीक, आयन चैनल कैनेटीक्स और electrophysiological गुणों के साथ संयोजन के रूप में आगे प्रोटीन गति extracellularly लागू fluorophores, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रविष्टि, या अप्राकृतिक अमीनो एसिड के समावेश की सिस्टीन विकार के माध्यम से पता लगाया है जहां वोल्टेज दबाना fluorometry, का उपयोग करके assayed किया जा सकता है ब्याज ¹ के क्षेत्र में. इस अतिरिक्त डेटा फ्लोरोसेंट अणु आसपास के microenvironment में परिवर्तन के माध्यम से प्रोटीन की वोल्टेज पर निर्भर गठनात्मक rearrangements के बारे में गतिज जानकारी पैदावार.

Introduction

विशिष्ट वोल्टेज clamping तकनीक नियंत्रित झिल्ली क्षमता पर आयनिक धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति. व्यापक रूप से दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना (TEVC) का इस्तेमाल किया और पैच दबाना तकनीक कई आयन चैनल के गुणों पर विश्वसनीय electrophysiological जानकारी प्रदान करते हैं. हालांकि, इन तरीकों के दोनों तेज वोल्टेज gated सोडियम चैनल और ऐसे Xenopus oocytes की उन के रूप में झिल्ली में अन्य तेजी से सक्रिय चैनल के लिए विश्वसनीय डेटा के अधिग्रहण को रोकने कि कमियां हैं. Bezanilla और स्टेफनी प्रयोगशालाओं फलस्वरूप oocytes ² के लिए कट खुला वैसलीन खाई वोल्टेज दबाना तकनीक (COVG) विकसित की है. तकनीक, ना ^{+, +} K, और सीए ^{2 +} चैनलों ^3-8 रिकॉर्ड करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया गया है.

COVG रिकॉर्डिंग के दौरान, एक heterologous प्रोटीन व्यक्त oocyte झिल्ली तीन क्षेत्रों में बांटा गया है. आयनिक मौजूदा डेटा के रूप में oocyte के शीर्ष क्षेत्र से दर्ज की गई हैशीर्ष क्षेत्र के आसपास के स्नान को आसानी से और जल्दी से बदला जा सकता है जो एक आदेश क्षमता, clamped है. मध्य क्षेत्र शीर्ष क्षेत्र ⁹ के रूप में एक ही क्षमता के लिए clamped किया जा रहा से रिसाव धाराओं के खिलाफ गार्ड. oocyte उद्घाटन (कट) खुला एक सैपोनिन समाधान या एक प्रवेशनी के उपयोग के माध्यम से होता है, जहां नीचे क्षेत्र है. रासायनिक या नीचे क्षेत्र में झिल्ली का मार्गदर्शन उद्घाटन भूमि से जोड़े, जो आंतरिक क्षमता के नियंत्रण की अनुमति देता है, और निचले सदन के समाधान के साथ सेल इंटीरियर सटे renders. शीर्ष चैम्बर में समाधान विनिमय बाहरी परिवेश को बदल देता है, जबकि निचले सदन में समाधान के छिड़काव, आंतरिक वातावरण के गुणों को समायोजित कर सकते हैं.

चित्रा 1. Oocyte कट ओपन वोल्टेज दबाना स्नान सेटअप आरेख. (ए) ऊपरएक दूसरे से अलग तीन स्नान के मद्देनजर नीचे. COVG के लिए कक्षों का आयाम चित्रा पर प्रदर्शित कर रहे हैं. (बी) के परीक्षण की स्थिति में स्नान सेटअप के साइड देखें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

COVG तकनीक के फायदे कम मौजूदा शोर (3 kHz पर 1 ना), विदेशी मीडिया की आयनिक रचना, आंतरिक मीडिया, तेजी से समय संकल्प (के क्षय के 20-100 μsec समय लगातार मिलाना करने की क्षमता का नियंत्रण शामिल क्षमता क्षणिक), और कई घंटे ⁹ के लिए स्थिर रिकॉर्डिंग. नुकसान यह विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और यह दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज clamping (TEVC) ¹⁰ की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए और अधिक कठिन है कि कर रहे हैं.

COVG दृष्टिकोण अति विशिष्ट उपकरण और जटिल प्रक्रिया संबंधी तत्वों की आवश्यकता होती है, यह valu के अधिग्रहण के लिए अनुमति दे सकते हैंसक्षम electrophysiological डेटा. इस तरह के उपवास कैनेटीक्स और पूंछ धाराओं के साथ ⁴ धाराओं gating के रूप में इस डाटा, चैनल चलाने के नीचे सहित अन्य वोल्टेज clamping प्रोटोकॉल के साथ जुड़े मुद्दों में से कुछ के बिना दर्ज किया जा सकता है. COVG सेटअप मामूली संशोधनों के तापमान नियंत्रकों और वोल्टेज दबाना fluorometry (वीसीएफ) के उपयोग के लिए अनुमति दे सकते हैं. COVG विधानसभा के भीतर वोल्टेज दबाना fluorometry तत्वों के शामिल किए जाने के साथ ही साथ वर्तमान ^11-13 जबकि रिकॉर्डिंग प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करके डेटा उत्पादन बढ़ाने कर सकते हैं.

Protocol

1. प्रारंभिक उपकरण सेटअप विद्युत और यांत्रिक शोर को रोकने के लिए एक आसपास के फैराडे पिंजरे के साथ एक कंपन अलगाव प्रणाली (उदाहरण के लिए एक हवाई तालिका) पर मंच और microelectrode जोड़तोड़ रखें. 24 AWG तार की छह…

Representative Results

चित्रा 4 दिखाता एक सैपोनिन समाधान के रूप में oocyte की पारगम्यता में परिवर्तन oocyte के नीचे अनुभाग के लिए आवेदन किया है. 5 सैपोनिन permeabilization निम्नलिखित प्रसार द्वारा intracellular समाधान विनिमय की दर को दर्शा?…

Discussion

कट खुला oocyte वैसलीन खाई वोल्टेज दबाना तकनीक डेटा का तेजी से समाधान के लिए अनुमति देता है, कम शोर, अपेक्षाकृत लंबे प्रोटोकॉल ¹⁹ से अधिक आंतरिक समाधान और बाहरी समाधान संरचना पर नियंत्रण, और स्थिर रिकॉर्?…

Materials

External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.