Cytologisk Analyse spermatogenese: Skarp og Faste Preparater av<em> Drosophila</em> Testikler

Summary

Metoder for å isolere og forbereder Drosophila testikler prøver (lever og fast) for avbildning av fase-kontrast og fluorescens mikroskopi er beskrevet her.

Abstract

Drosophila melanogaster er et kraftig modellsystem som har blitt mye brukt for å belyse en rekke biologiske prosesser. For eksempel har studier over både kvinnelige og mannlige kjønns linjer av Drosophila bidratt sterkt til den nåværende forståelse av meiose samt stamcelle biologi. Utmerket protokoller er tilgjengelige i litteraturen for isolering og avbildning av Drosophila eggstokker og testikler ^3-12. Heri er fremgangsmåter for disseksjon og fremstillingen av Drosophila testes for mikroskopisk analyse beskrevet i forbindelse med en tilhørende video-demonstrasjon. En protokoll for isolering av testikler fra buken av voksne menn og fremstilling av lysbilder av levende vev for analyse ved fase-kontrastmikroskopi, så vel som en protokoll for feste og farging prøvene for analyse ved fluorescens mikroskopi er presentert. Disse teknikkene kan bli anvendt i den karakteriseringen av Drosophila mutanter som oppviser defects i spermatogenesen samt i visualisering av subcellulære lokaliseringer av proteiner.

Introduction

Drosophila Testiklene er en ideell modell system for studier av mange biologiske prosesser, inkludert regulering av stamceller, meiose, og sperm utvikling ^13-18. De spermatocytter og deres meiotisk spindler er store og dermed praktisk for cytologisk analyse, og avslappede cellesyklus sjekkpunkter under spermatogenesis rette studiet av mutasjoner i cellesyklus gener. Forskjellige celletyper kan observeres i beordret progresjon langs lengden av testiklene, og en hvilken som helst forstyrrelse av spermatogenesen kan føre til endringer i denne generelle arrangement. Disse funksjonene kombinert med Drosophila genetiske verktøy har muliggjort mutational analyse av spermatogenesen ^21-23.

Stadier av Drosophila spermatogenesen er godt definert. Kimlinje-celler som utvikler seg synkront i løpet av cyster fremgang sekvensielt gjennom stadier av spermatogenesen langs lengden av testiklene. Under both den mitotiske og meiotisk divisjoner av de mannlige kjønnsceller, oppstår cytokinese ufullstendig slik at dattercellene forbli tilkoblet med cytoplasmatiske broer kjent som kanalringer (Figur 1). Den apikale spissen av testis inneholder en befolkning på germline stamceller som gir opphav til spermatogonial celler, som gjennomgår fire mitotiske divisjoner med ufullstendig cytokinese å generere 16-celle cyster av primær spermatocytter. Etter premeiotic S-fasen, primær spermatocytter inn G2, en langvarig vekstperiode på ~ 90 timer og i løpet cellular volumøkninger ~ 25-fold. Progresjon gjennom meiose I og meiose II resultater i dannelsen av 32-celle cyster av sekundære spermatocytter og 64-celle cyster av haploide spermatider, henholdsvis. Umodne, runde spermatider gjennomgå omfattende cellular ombygging for å danne modne sædceller. Post-meiotisk celler, særlig de bunter av elongating og modne spermatider, opptar mye av volumet i testis.

Than vellykket transport av funksjonell sperm til kvinnelige fluer krever koordinering mellom de ulike delene av det mannlige reproduksjonssystemet, som er sammensatt av flere sammenkoblede strukturer (testiklene, sædblærene og tilbehør kjertler) og et enkelt uttømmelsesrør (figur 2). Sperm produseres i testiklene og lagres innen sædblærene inntil parr ^24. Tilbehørs kjertler inneholde sekresjonscellene som produserer sædvæske. Sperm migrerer fra sædblærene blandes med sædvæsken innenfor uttømmelsesrør, som er koblet til begge sædblærene og tilbehørs kjertler. Denne blanding av spermier og seminal væske er til slutt pumpes ut av hann inn i vagina i den kvinnelige fly gjennom ejaculatory bulb som ligger ved den bakre enden av det mannlige abdomen ^25.. Proteiner i sædvæsken er avgjørende for langvarig lagring av sæd innenfor spesialiserte organer kjent som lommene på reproductive kanalen av Drosophila kvinner ^26.

Utmerket fremgangsmåter for isolering av Drosophila testikler og visualisering av celler på ulike stadier av spermatogenesen er tilgjengelige i den vitenskapelige litteraturen ^3-12. Vi her legge til denne kroppen av kunnskap ved å presentere eksempler på disse protokollene med en medfølgende videodemonstrasjon. Protokollen for fremstilling av levende testikler prøver for fase-kontrastmikroskopi er basert på en tidligere beskrevet metode ^27. Protokollen for formaldehyd fiksering og farging av testiklene er også basert på en tidligere beskrevet metode ^28. De metoder som er beskrevet her har blitt brukt i mange undersøkelser av Drosophila spermatogenese (for eksempel for å vurdere rollen som dynein, et minus-ende-rettet microtubule motor, under Drosophila spermatogenese).

I tillegg til de grunnleggende protokoller, er forslag gitt for variasjong disseksjon, slik som å berike for spermatogonier, spermatocytter, eller moden sperm. Forskjellige fremgangsmåter for å behandle prøvene slik det cyster forblir enten intakt eller blir forstyrret etter behov, er beskrevet. En fordel ved bruk av Drosophila testikler som modellsystem er at, sammenlignet med Drosophila oocytter og embryoer, kan antistoffer og fargestoffer lett trenge celler etter deres spredning fra prøvene, og færre vasketrinn er nødvendig, og derfor kan protokoller bli utført i en relativt kort tid.

Protocol

En. Testikler Dissection Anesthetize fluer i en flaske eller hetteglass ved hjelp av en strøm av CO 2 og overføre til en flue pad. Sortering fluer under et dissekerende mikroskop ved hjelp av en liten pensel, og samle inn et passende antall (avhengig av eksperimentet) av Drosophila hanner av de ønskede genotyper. Unge menn (0-2 dager gamle) er ideelle for å undersøke celler gjennom tidligere stadier av spermatogenesen (f.eks spermatogonier, spermatocytter, og tidlig…

Representative Results

Et eksempel på en skikkelig dissekert par av Drosophila mannlige kjønnsorganer er vist i figur 2A. Testes fjernet fra bukhulen av den voksne mannlige fly er vanligvis knyttet til uttømmelsesrør (brun, figur 2A ') og et par av aksessoriske kjertler (grønn, figur 2A') via et par av sædblærene (blå, figur 2A ') . For å skille testiklene fra de fleste av den medfølgende somatisk vev, uttømmelsesrør og tilbehøret kjertler b?…

Discussion

Selv om testiklene av vill type fluer lett kan identifiseres på grunn av sin gule farge (i motsetning nabo hvite vev), testiklene av hvite mutant fluer er hvit og dermed kan noen ganger forveksles med tarmen. Mest transgene stammer, som er typisk i en hvit bakgrunn, har også hvite testiklene fordi mini-hvite genet finnes i P-elementer ikke fremme pigment opphopning i testiklene. Når Drosophila testiklene ikke kan være preget av farge, andre lett gjenkjennelige funksjoner …

Materials

Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss