توضح هذه الورقة كيف يمكن أن يجمد على الزرد الكبار، مدخل أنبوب، وتستخدم لفي التجارب المجراة الكهربية للسماح التسجيلات والتلاعب في النشاط العصبي في حيوان سليمة.
سابقا، دراسات الكهربية في الزرد الكبار اقتصرت على شريحة الاستعدادات أو لاستعدادات كأس العين والتسجيلات electrorentinogram. توضح هذه الورقة كيف يمكن أن يجمد على الزرد الكبار، مدخل أنبوب، وتستخدم لفي التجارب المجراة الكهربية، مما يتيح تسجيل النشاط العصبي. تجميد الكبار يتطلب آلية لتقديم الأكسجين الذائب إلى الخياشيم بدلا من الحركة والشدق وصادي. مع أسلوبنا، ويجمد الحيوانات ومع perfused المياه الموائل للوفاء بهذا المطلب. يتم إجراء حج القحف تحت تريكين methanesulfonate (MS-222؛ تريكين) التخدير لتوفير الوصول إلى الدماغ. ثم يتم وضع القطب الأساسي ضمن إطار حج القحف لتسجيل نشاط المخ خارج الخلية. من خلال استخدام نظام نضح multitube، ومجموعة متنوعة من المركبات الدوائية يمكن أن تدار على الأسماك الكبار وأي تعديلات في النشاط العصبيويمكن ملاحظة. المنهجية لا يسمح للالملاحظات إلى أن تتخذ بشأن التغيرات في النشاط العصبي، ولكنه يسمح أيضا لإجراء مقارنات بين اليرقات والزرد الكبار. وهذا يعطي الباحثين القدرة على تحديد التغيرات في النشاط العصبي نتيجة لإدخال مركبات مختلفة في مراحل الحياة المختلفة.
في هذه المقالة، يوصف بروتوكول للحصول على التسجيلات في الجسم الحي من النشاط العصبي في الزرد الكبار. وتستخدم أساليب تسجيل خارج الخلية، وتوفير قياسات الجهد من النشاط الكهربائي داخل منطقة صغيرة من الأنسجة العصبية. هذا الأسلوب من التحقيق ينطوي على رصد عدد كبير من الخلايا في حيوان يتصرف 1. سابقا، وقد أجريت تسجيلات شريحة في كل من البالغين واليرقات، وكذلك الاستعدادات كوب العين والتسجيلات مخطط كهربية الشبكية. إلى حد كبير تم تنفيذ هذه التجارب بالتفاصيل الاستجابات الفسيولوجية لمختلف الأنظمة الحسية 2-5. حتى وقت قريب، كانت الاستعدادات الدماغ سليمة متوفرة لأداء الكهربية مع الزرد 3،6،7 يرقة، حيث يمكن أن يحدث التنفس والأوكسجين نشرها من خلال الجلد فقط. إعداد لدينا يسمح النشاط عصبية الأم من الزرد الكبار أن تقاس بينما يبقى حيوان واعية تماما ومدركة سو محيطها.
الزرد (دانيو rerio) تلعب حاليا دورا أساسيا بوصفها نموذجا للدراسات الجينية، السمية، الدوائية، وphysiopathological 3. اكتسبت الزرد الرؤية ضمن مجال علم الأعصاب لأنها تناظر مشاركة مكثفة مع الثدييات في الوراثية، والغدد الصماء العصبية مستويات 8. على مدى العقد الماضي، وقد استخدمت تقنيات neuroanatomic والمناعى لتحديد معيار المنظمة مميزة مفصلة للجهاز العصبي الزرد 9-12 وتوزيع الناقلات العصبية المختلفة 3،8،13. في الآونة الأخيرة، تحولت الباحثين التركيز على الدراسات الفنية 14،15، وكثير منها تركز على العمليات السلوكية والخصائص الكهربية 16-19 من أنظمة حسية 2،13،20. وركزت وهناك عدد قليل من هذه الدراسات على النشاط الكهربائي للمناطق معينة من أدولر الدماغ الزرد 21-23، ولكن لم تنفذ باستخدام نهج في الجسم الحي.
هذا البروتوكول يمكن تكييفها للدراسات الكهربية في كل من النشاط العفوي والمسموعة داخل الجهاز العصبي الزرد لوصف أنماط النشاط في مناطق محددة في الدماغ. استخدام هذه التقنية تتيح إجراء مقارنات بين النشاط العصبي من مراحل اليرقات والبالغين الشباب. علاوة على ذلك، يسمح بروتوكول لدينا مقارنات بين تعديلات وراثية أو الدوائية. جنبا إلى جنب مع المناهج الأخرى، مثل الهندسة الوراثية أو الاختبارات الدوائية، وهذه الطريقة توفر إمكانية جديدة لتحليل وظيفي للاتصال الخلايا العصبية واللدونة في حيوان بالغ سليمة فضلا عن التطبيقات المحتملة، مثل دراسة أواخر الصرع أو بداية العمليات الاعصاب.
وقد استخدم هذا البروتوكول لقياس النشاط العصبي من الزرد الكبار في الجسم الحي. مع الممارسة، النشاط العصبي يمكن ملاحظتها باستمرار، على الرغم من أن الخصائص (السعة وشكل الأحداث) من النشاط المسجل يمكن أن تختلف بين الأسماك الفردية. الاستفادة من تقنيات التسجيل خارج الخ…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS غرانت R01NS070159 (لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى، ورابطة الدفاع اليهودية ATS).
70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
Sponge | Small pore and chemical-free | ||
Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
9 V Battery | |||
Wires with alligator clips | Need 2 | ||
37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
1/8 in diameter tube | |||
1 cm diameter tube | |||
1 mm diameter tube | |||
Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
3-way Stopcocks with Luer connections | |||
1-way Stopcock with Luer connection | |||
Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
Axoclamp software | Molecular Devices | ||
HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
10 ml Luer lock syringe | |||
1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
Microsoft-based PC | Dell | ||
Faraday Cage | |||
Air Table | |||
Dissecting Microscope |