تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار
Summary
توضح هذه الورقة كيف يمكن أن يجمد على الزرد الكبار، مدخل أنبوب، وتستخدم لفي التجارب المجراة الكهربية للسماح التسجيلات والتلاعب في النشاط العصبي في حيوان سليمة.
Abstract
سابقا، دراسات الكهربية في الزرد الكبار اقتصرت على شريحة الاستعدادات أو لاستعدادات كأس العين والتسجيلات electrorentinogram. توضح هذه الورقة كيف يمكن أن يجمد على الزرد الكبار، مدخل أنبوب، وتستخدم لفي التجارب المجراة الكهربية، مما يتيح تسجيل النشاط العصبي. تجميد الكبار يتطلب آلية لتقديم الأكسجين الذائب إلى الخياشيم بدلا من الحركة والشدق وصادي. مع أسلوبنا، ويجمد الحيوانات ومع perfused المياه الموائل للوفاء بهذا المطلب. يتم إجراء حج القحف تحت تريكين methanesulfonate (MS-222؛ تريكين) التخدير لتوفير الوصول إلى الدماغ. ثم يتم وضع القطب الأساسي ضمن إطار حج القحف لتسجيل نشاط المخ خارج الخلية. من خلال استخدام نظام نضح multitube، ومجموعة متنوعة من المركبات الدوائية يمكن أن تدار على الأسماك الكبار وأي تعديلات في النشاط العصبيويمكن ملاحظة. المنهجية لا يسمح للالملاحظات إلى أن تتخذ بشأن التغيرات في النشاط العصبي، ولكنه يسمح أيضا لإجراء مقارنات بين اليرقات والزرد الكبار. وهذا يعطي الباحثين القدرة على تحديد التغيرات في النشاط العصبي نتيجة لإدخال مركبات مختلفة في مراحل الحياة المختلفة.
Introduction
في هذه المقالة، يوصف بروتوكول للحصول على التسجيلات في الجسم الحي من النشاط العصبي في الزرد الكبار. وتستخدم أساليب تسجيل خارج الخلية، وتوفير قياسات الجهد من النشاط الكهربائي داخل منطقة صغيرة من الأنسجة العصبية. هذا الأسلوب من التحقيق ينطوي على رصد عدد كبير من الخلايا في حيوان يتصرف 1. سابقا، وقد أجريت تسجيلات شريحة في كل من البالغين واليرقات، وكذلك الاستعدادات كوب العين والتسجيلات مخطط كهربية الشبكية. إلى حد كبير تم تنفيذ هذه التجارب بالتفاصيل الاستجابات الفسيولوجية لمختلف الأنظمة الحسية 2-5. حتى وقت قريب، كانت الاستعدادات الدماغ سليمة متوفرة لأداء الكهربية مع الزرد 3،6،7 يرقة، حيث يمكن أن يحدث التنفس والأوكسجين نشرها من خلال الجلد فقط. إعداد لدينا يسمح النشاط عصبية الأم من الزرد الكبار أن تقاس بينما يبقى حيوان واعية تماما ومدركة سو محيطها.
الزرد (دانيو rerio) تلعب حاليا دورا أساسيا بوصفها نموذجا للدراسات الجينية، السمية، الدوائية، وphysiopathological 3. اكتسبت الزرد الرؤية ضمن مجال علم الأعصاب لأنها تناظر مشاركة مكثفة مع الثدييات في الوراثية، والغدد الصماء العصبية مستويات 8. على مدى العقد الماضي، وقد استخدمت تقنيات neuroanatomic والمناعى لتحديد معيار المنظمة مميزة مفصلة للجهاز العصبي الزرد 9-12 وتوزيع الناقلات العصبية المختلفة 3،8،13. في الآونة الأخيرة، تحولت الباحثين التركيز على الدراسات الفنية 14،15، وكثير منها تركز على العمليات السلوكية والخصائص الكهربية 16-19 من أنظمة حسية 2،13،20. وركزت وهناك عدد قليل من هذه الدراسات على النشاط الكهربائي للمناطق معينة من أدولر الدماغ الزرد 21-23، ولكن لم تنفذ باستخدام نهج في الجسم الحي.
هذا البروتوكول يمكن تكييفها للدراسات الكهربية في كل من النشاط العفوي والمسموعة داخل الجهاز العصبي الزرد لوصف أنماط النشاط في مناطق محددة في الدماغ. استخدام هذه التقنية تتيح إجراء مقارنات بين النشاط العصبي من مراحل اليرقات والبالغين الشباب. علاوة على ذلك، يسمح بروتوكول لدينا مقارنات بين تعديلات وراثية أو الدوائية. جنبا إلى جنب مع المناهج الأخرى، مثل الهندسة الوراثية أو الاختبارات الدوائية، وهذه الطريقة توفر إمكانية جديدة لتحليل وظيفي للاتصال الخلايا العصبية واللدونة في حيوان بالغ سليمة فضلا عن التطبيقات المحتملة، مثل دراسة أواخر الصرع أو بداية العمليات الاعصاب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم هذا البروتوكول لقياس النشاط العصبي من الزرد الكبار في الجسم الحي. مع الممارسة، النشاط العصبي يمكن ملاحظتها باستمرار، على الرغم من أن الخصائص (السعة وشكل الأحداث) من النشاط المسجل يمكن أن تختلف بين الأسماك الفردية. الاستفادة من تقنيات التسجيل خارج الخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS غرانت R01NS070159 (لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى، ورابطة الدفاع اليهودية ATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. . Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. . Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
