कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग EGFP टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक की आसान माप
Summary
इस पत्र की fluorescently लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन लेबल प्रसार गुणांक को मापने के लिए उतार – चढ़ाव विश्लेषण तकनीक कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (kICS) के लिए कदम गाइड द्वारा एक कदम प्रदान करता है.
Abstract
पार्श्व प्रसार और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की compartmentalization कसकर कोशिकाओं में विनियमित रहे हैं और इस प्रकार, इन प्रक्रियाओं का अध्ययन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन समारोह और विनियमन के लिए नए अंतर्दृष्टि खोलेगा. हाल ही में, कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (kICS) 1 सीधे जांच Photophysics द्वारा शुरू की व्यवस्थित पूर्वाग्रहों से बचा कि fluorescently टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की छवियों, से प्रसार गुणांक की दिनचर्या माप सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था. विश्लेषण के लिए सैद्धांतिक आधार जटिल है हालांकि, विधि प्रोटीन का प्रसार गुणांक को मापने के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कोड का उपयोग कर nonexperts द्वारा कार्यान्वित किया जा सकता है. kICS पारस्परिक (कश्मीर) अंतरिक्ष करने के लिए प्रत्येक छवि के फूरियर परिवर्तन के बाद एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि ढेर से एक समय सहसंबंध समारोह गणना करता है. बाद में, परिपत्र औसतन, प्राकृतिक लघुगणक बदलने और रैखिक पैदावार सहसंबंध समारोह के लिए प्रसार गुणांक फिट बैठता है. यहकागज kICS के माध्यम से छवि विश्लेषण और प्रसार गुणांक की माप के लिए एक कदम दर कदम मार्गदर्शन प्रदान करता है.
सबसे पहले, एक fluorescently लेबल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का एक उच्च फ्रेम दर छवि अनुक्रम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग अधिग्रहण कर लिया है. फिर, ब्याज (आरओआई) झिल्ली क्षेत्रों, intracellular organelles परहेज पुटिका चलती है या फैला हुआ की एक क्षेत्र का चयन किया है. आरओआई ढेर एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कोड में आयात किया जाता है और कई परिभाषित मापदंडों (विधि अनुभाग देखें) kICS विश्लेषण के लिए सेट कर रहे हैं. कार्यक्रम तो कश्मीर अंतरिक्ष समय सहसंबंध कार्यों से साजिश एक "ढलान की ढलान" उत्पन्न करता है, और प्रसार गुणांक भूखंड की ढलान से गणना की है. नीचे एक विहित उदाहरण के रूप में EGFP के साथ टैग गुर्दे पानी चैनल aquaporin-3 का उपयोग कर एक झिल्ली प्रोटीन के गुणांक प्रसार को मापने के लिए एक कदम दर कदम kICS प्रक्रिया है.
Introduction
प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की चार आयामी spatiotemporal संगठन और पार्श्व गतिशीलता कसकर विनियमित रहे हैं और प्रोटीन समारोह, गतिविधि और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में एक भूमिका निभा सकते हैं. प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के पार्श्व प्रसार, पारंपरिक रूप से क्वांटम डॉट के समय चूक इमेजिंग से एक कण के लिए प्रसार गुणांक की गणना या लेबल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन 2-4 डाई द्वारा अध्ययन किया गया है. यह दृष्टिकोण प्रोटीन तह और समारोह समझौता कर सकते हैं और इस तरह, कुछ प्रोटीन के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है जो क्वांटम डॉट या डाई लेबलिंग के लिए प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन, में एक बाह्य टैग की प्रविष्टि की आवश्यकता है. एक क्वांटम डॉट की steric मात्रा प्रोटीन 5 का प्रसार धीमा करने के लिए और इसके अलावा, जनसंख्या में प्रोटीन की केवल एक छोटे से अंश क्वांटम डॉट्स के साथ चिह्नित कर रहे हैं दिखाया गया है, और इस अंश कुल के लिए प्रतिनिधि है अगर यह ज्ञात नहीं है प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के पूल. एक कण टीआरएक्वांटम डॉट लेबल प्रोटीन की छवि श्रृंखला से प्रसार गुणांक के cking (SPT) माप मानचित्रण दो आयामी गाऊसी के कणों के साथ imaged शिखर पदों पर व्यापक विश्लेषण एल्गोरिदम द्वारा पीछा फिट बैठता शामिल है. विश्लेषण का वर्णन कण trajectories में माइक्रोस्कोप बात फैल समारोह (आमतौर पर दो आयामी स्थानिक Gaussians) और कण पदों के बाद से जोड़ने का अनुमान इस के लिए एक समय चूक अनुक्रम की प्रत्येक छवि फ्रेम में फिटिंग व्यापक गैर रेखीय वक्र की आवश्यकता होती है, computationally बहुत गहन है एकल अणुओं 6,7 की गति.
हाल ही में विकसित छवि सहसंबंध तकनीक, कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (kICS) की fluorescently प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन में चिह्नित प्रसार गुणांक के रिश्तेदार सरल माप सक्षम बनाता है. नियमित kICS द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक की गणना करने की संभावना रखती है जो एक अनूठे उपकरण हैपारंपरिक क्वांटम पर कई फायदे SPT विश्लेषण डॉट: बाह्य लेबलिंग लेने कोशिकी टैग और समय की कोई प्रविष्टि (फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है) की आवश्यकता है; प्रसार गुणांक क्वांटम डॉट्स के साथ लेबल एक सबसेट की तुलना में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कुल पूल से निकाले जाते हैं; विश्लेषण एक प्रोटीन को ट्रैक करने की आवश्यकता के बिना सरल है और विश्लेषण अतिरिक्त उपयोगकर्ता प्रोग्रामिंग के लिए कोई आवश्यकता के साथ एक मौजूदा कोड का उपयोग किया जा सकता है. यह प्रसार गुणांक की तेजी गणना और गणना में सक्षम बनाता है जो एक औसत तकनीक है क्योंकि विधि तेजी है. प्रोटीन की आबादी के लिए इन तेजी से प्रसार माप श्रमसाध्य SPT तरीकों से आबादी का एक सबसेट के लिए प्राप्त की और अधिक विस्तृत आणविक परिवहन जानकारी के पूरक हैं.
kICS समय पहले फूरियर अंतरिक्ष के लिए बदल दिया गया है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि दृश्यों संबद्ध है, और इस तरह FL अलग करती हैआणविक परिवहन 1 के कारण उन से Photophysics के कारण uorescence उतार चढ़ाव. नतीजतन, kICS, संख्या घनत्व निर्धारित गति प्रवाह, और जटिल photobleaching द्वारा निष्पक्ष जा रहा है या fluorophores के निमिष जबकि प्रसार की fluorescently अणुओं लेबल कर सकते हैं. इस kICS जल्दी कस्टम लिखने एल्गोरिदम की आवश्यकता के बिना fluorescently लेबल कोशिका झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बना देता है. इसके अलावा fluorescently लेबल प्रोटीन, kICS भी क्वांटम डॉट लेबल झिल्ली प्रोटीन 8 के लिए लागू किया जा सकता है.
इस पत्र कोड और कैसे उत्पन्न भूखंडों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग करने के लिए कैसे, फसल स्थान के लिए प्रदर्शन कैसे द्वारा EGFP टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक निकालने के लिए kICS का उपयोग करने के लिए एक कदम दर कदम परिचय देता है जो प्रसार से गुणांकों निकाले जाते हैं. एक उदाहरण के रूप में, अर्द्ध कुल आंतरिक प्रतिबिंब में डिस्क माइक्रोस्कोपी सेट कताई द्वारा प्राप्त आंकड़ों प्रतिदीप्तिEGFP के साथ टैग एक गुर्दे पानी चैनल प्रोटीन aquaporin -3 (AQP3) की nce (TIRF) मोड, प्रस्तुत किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग प्रोटीन की माइक्रोस्कोपी छवियों से प्रसार गुणांक का निर्धारण करने के लिए kICS विश्लेषण पद्धति लागू करने के लिए एक विस्तृत कदम दर कदम अवलोकन प्रस्तुत किया. विश्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम LNN तक एक लंडबेक जूनियर ग्रुप लीडर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. PWW प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से अनुदान धन समर्थन मानता है. हम भी डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए उपयोग के लिए दक्षिणी डेनमार्क विश्वविद्यालय में डेनिश आण्विक Bioimaging केंद्र धन्यवाद.
Materials
References
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
