Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Difusión lateral y la compartimentación de proteínas de la membrana de plasma están fuertemente regulados en las células y, por tanto, el estudio de estos procesos se revelan nuevas perspectivas al plasma la función de proteínas de membrana y la regulación. Recientemente, k-espacio de correlación de imágenes de espectroscopia (CCI) ¹ fue desarrollado para permitir mediciones de rutina de los coeficientes de difusión directa a partir de imágenes de proteínas de la membrana plasmática marcados con fluorescencia, que evitaron sesgos sistemáticos introducidos por fotofísica sonda. Aunque la base teórica para el análisis es complejo, el método puede ser implementado por los no expertos utilizando un código libremente disponibles para medir los coeficientes de difusión de las proteínas. CCI calcula una función de correlación de tiempo a partir de una imagen Pila microscopía de fluorescencia después de la transformación de Fourier de cada imagen para recíproca (k-) el espacio. Posteriormente, promediado circular, logaritmo natural transformada lineal y se ajusta a la función de correlación se obtiene el coeficiente de difusión. Estedocumento proporciona una guía paso a paso para el análisis de imágenes y la medición de los coeficientes de difusión a través de las CCI.

En primer lugar, una secuencia de imágenes de alta velocidad de fotogramas de una proteína de membrana plasmática marcada con fluorescencia se adquiere mediante un microscopio de fluorescencia. Entonces, se selecciona una región de interés (ROI) evitando orgánulos intracelulares, vesículas en movimiento o que sobresale regiones de membrana. La pila de retorno de la inversión se importa en un código de libre acceso y varios parámetros definidos (véase la sección Método) se establecen para el análisis de las CCI. Entonces, el programa genera una "pendiente de las laderas" complot de las funciones de correlación de tiempo k-espacio, y el coeficiente de difusión se calcula a partir de la pendiente de la parcela. A continuación se muestra un procedimiento paso a paso las CCI para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana utilizando el renal canal de agua acuaporina-3 etiquetados con EGFP como un ejemplo canónico.