Shock Wave Toepassing op celculturen
Summary
Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Daarom in vitro experimenten zijn van toenemend belang. We hebben daarom een model ontwikkeld voor in vitro schokgolf trials (IVSWT) die ons in staat stelt om na te bootsen in vivo omstandigheden waardoor storende fysieke effecten te vermijden.
Abstract
Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Fundamenteel onderzoek bevindingen bleek dat schokgolven veroorzaken een biologische prikkel om cellen of weefsel te richten zonder eventuele gevolgschade. Daarom, in vitro experimenten van toenemend belang. Verschillende methoden voor het aanbrengen schokgolven op celkweken beschreven. In het algemeen, alle bestaande modellen richten op hoe schokgolven beste toepassen op cellen.
Echter, deze vraag blijft: Wat gebeurt er met de golven na het passeren van de celkweek? Het verschil van de akoestische impedantie van het celkweekmedium en de lucht is zo hoog, dat meer dan 99% van schokgolven gereflecteerd! We hebben daarom een model ontwikkeld dat voornamelijk bestaat uit een plexiglas gebouwde container die het mogelijk maakt de golven te verspreiden in het water na het passeren van de celkweek. Dit voorkomt cavitatie effecten evenals reflectie van de golven die anders nog te houden zou verstoren. With dit model zijn we in staat om in vivo omstandigheden na te bootsen en zo krijgen meer en meer kennis over hoe de fysieke prikkel van schokgolven wordt vertaald in een biologische cel-signaal ("mechanotransduction").
Introduction
Schokgolven zijn geluidsdrukgolven die voortvloeien uit een plotseling vrijkomen van energie, bijvoorbeeld. als donder bij bliksem. In de geneeskunde schokgolven worden al meer dan 30 jaar Lithotripsie de desintegratie van nierstenen. Aangezien de incidentele vaststelling van iliacale bot verdikking bij Lithotripsie patiënten in de vroege jaren 1980, werd eerste studies uitgevoerd om het effect van drukgolfbehandeling (SWT) op botgenezing 1 evalueren. Indrukwekkende resultaten van een betere genezing van de lange bot nonunions kon worden waargenomen 2. Vervolgens werden aanwijzingen uitgebreid zacht weefsel wonden 3. Fundamenteel onderzoek bevindingen bleek dat schokgolven veroorzaken een biologische prikkel om het te onderzoeken weefsel zonder eventuele gevolgschade. Vrijgave van angiogene groeifactoren (bijvoorbeeld VEGF, PlGF, FGF) wordt gevolgd door aanzienlijke angiogenese. Dit leidde tot een verdere uitbreiding van indicaties naar ischemische pathologieën. Onze groep en anderen toonden de positieve effect van SWT op ischemische hartziekte in diermodellen als in klinische studies 4-6.
Echter, het exacte mechanisme van hoe de fysieke prikkel van SWT wordt vertaald in een biologisch signaal (mechanotransduction) blijft grotendeels onbekend. Omdat de belangstelling voor SWT uit verschillende gebieden van de geneeskunde neemt voortdurend toe, is de zoektocht naar het mechanisme steeds meer en intenser. Daarom worden in vitro schokgolf experimenten steeds belangrijker. Naast vermindering van dierproeven en kosteneffectiviteit, kan het grootste voordeel van in vitro schokgolf behandeling (IVSWT) de mogelijkheid van het bestuderen van de specifieke werking van een bepaald type cel. In schokgolf gemedieerde weefselregeneratie waarschijnlijk alle cellen van het behandelde weefsel betrokken zijn, zelfs systemische effecten besproken. Toch heeft elk type cel speelt een specifieke rol en heeft een eigen intrinsieke functie. IVSWT stelt ons in staat om deze specifieke functie een te detecterennd daardoor geeft ons een beter begrip van de complexe onderliggende processen.
Kennis van vandaag over effecten schokgolf op celculturen omvat de toename van proliferatie, wijziging van celmembraanreceptoren, verhoging en versnelling van celdifferentiatie, afgifte van groeifactoren en chemo-lokstoffen evenals verhoogde cel migratie 7-9.
Storende fysieke effecten meeste in vitro modellen Verschillende methoden voor het aanbrengen schokgolven op celkweken beschreven. Dit feit leidt tot het probleem dat het zeer moeilijk resultaten te vergelijken, zoals lichamelijke toestand van cel stimulatie heel verschillend tussen deze modellen. In het algemeen, alle bestaande modellen richten op hoe schokgolven beste toepassen op cellen.
Echter, deze vraag blijft: Wat gebeurt er met de golven na het passeren van de celkweek? Het grootste probleem is dat het verschil in de akoestischeimpedantie van het celkweekmedium en de omgevingslucht is zo hoog, dat meer dan 99% van schokgolven gereflecteerd Figuur 1.
Door het verschil in akoestische impedantie van de twee media de golven niet alleen terug, maar een faseverschuiving van 180 ° komt die een sterke trekkrachten aan de cellen Figuur 2.
Akoestische impedantie wordt gedefinieerd als het product van de dichtheid van een materiaal en de geluidssnelheid Z = ρ x c. Voor water de akoestische impedantie is ZWater = 1440000 Ns / m 3, voor de lucht is het slechts 420 Ns / m 3. Het grote verschil tussen deze twee waarden resulteert in reflectie en faseverschuiving van schokgolven. De faseverschuiving blijkt een positieve druk puls in een trek-golf.
Hoewel deze trekkracht niet schadelijk voor de cellen, het interfereert met het idee nabootsen in vivo schokgolf effecten in vitro. In vivo dezetrekkrachten nauwelijks optreden als gevolg van grote lichaamsstructuren.
Bovendien kan de achterkant loopt golven zelfs verstoren de inkomende Ones. Dit kan storingen veroorzaken. Twee soorten storingen bekend. Constructieve interferentie betekent dat beide golven worden toegevoegd hetgeen resulteert in een verdubbeling amplitude Figuur 3. Destructieve interferentie treedt op als golven ontmoeten lijnrecht tegenover elkaar. Het veroorzaakt afschaffing van golven (Figuur 3). Daarom IVSWT moet een model dat schokgolven kunnen voortplanten na het passeren van de celkweek.
IVSWT waterbad
Overwegingen naar aanleiding van de bovengenoemde bezwaren leiden ons naar een waterbad voor het vermijden van het ontwerp van de beschreven problemen Figuur 4. Kortom, het bestaat uit een plexiglas gebouwde container met een membraan om elk soort schokgolf applicator verbinden. Voor koppeling tussen dit membraan en de applicator ultrageluidtransmissie geIk moet worden gebruikt. Het waterbad is gevuld met ontgast water cavitatie die zou optreden als gas werd soluted in het water te vermijden. Een kachel bij de bodem met een temperatuursensor verbonden met een regeleenheid stelt om gedurende imitatie van in vivo omstandigheden reguleren en celculturen vermijden tijdens de procedure afkoelen. De temperatuur kan stabiel worden gehouden op 37 graden Celsius als het wordt gedaan in een incubator. Een houder voor de cel monsters zorgt voor het onderdompelen van elke vorm van cultuur fles of buis. Daarbij moet het monster vaartuig volledig worden gevuld met kweekmedium, zoals luchtbellen schokgolven zouden blokkeren! Een wigvormige absorber aan de achterwand van het bad vernietigt golven om niet gereflecteerd en ren terug om interferentie te voorkomen.
Een verder voordeel van andere IVSWT modellen is de mogelijkheid van het variëren van de afstand tussen de applicator en de cultuur kolven. Bevindingen van onze groep en anderen die gebruik maken van dit model duidelijk ishoe dat elk type cel reageert zeer specifiek naar verschillende behandeling parameters. Bovendien bepalen de afstand tussen de bron van de golven en het monster is belangrijk omdat hiermee de cellen te controleren om op een bepaalde positie ten opzichte van de focus van de schokgolf applicator.
Protocol
Representative Results
Discussion
De betekenis van het voorgestelde model voor in vitro drukgolfbehandeling is het feit dat golven kunnen voortplanten na het passeren van de celkweek in tegenstelling tot bestaande modellen. Daardoor kunnen storende fysische effecten zoals trekkrachten worden vermeden. Het model lijkt meer op in vivo omstandigheden dan die door anderen toepassen golven om hun celkweekkolven direct.
Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid van het variëren van de afstand tussen schokgolf br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Reiner Schultheiss en Wolfgang Schaden voor hun inspiratie voor dit model. We danken ook Christian Dorfmüller voor zijn hele tijd enorme inspanningen om ons onderzoek te ondersteunen.
Veel dank aan Robert Göschl en Hans Hohenegger voor een zorgvuldige technische realisatie van onze ideeën!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
