Первичная культура человека вестибулярного шванномы

Summary

Вестибулярная Шванномы (VSS) не являются злокачественные опухоли Шванн клеток (СК) происхождения, связанные с мутациями в гене опухолевого супрессора NF2. Мы сообщаем о воспроизводимой, эффективный протокол для первичных человеческих VS культуре клеток, которая позволяет молекулярной и клеточной экспериментальной манипуляции и анализа и повторяет гетерогенную природу болезни человека.

Abstract

Вестибулярные шванном (VSS) представляют Шванн клетки (СК) опухолей вестибулярного нерва, ущерба 10% всех внутричерепных новообразований. VSs произойти в любом спорадических или семейных (нейрофиброматоз типа 2, NF2) формах, как связанных с инактивирующих дефектов в супрессоров опухолей NF2 ген. Лечение VSS, как правило, хирургическая резекция или радиохирургия, однако заболеваемость таких процедур привела расследования менее инвазивных процедур. Исторически сложилось так, отсутствие доступа к образцов свежих тканей и тем, что шваннома клетки не увековечена значительно затрудняло использование первичных культур для исследования шваннома опухолей. Чтобы преодолеть ограниченный запас первичных культурах, увековечены клеточная линия HEI193 В.С. был сгенерирован трансдукции ВПЧ Е6 и Е7 онкогенов. Это онкогенного трансдукции внесены существенные молекулярные и фенотипические изменения в клетках, которые ограничивают их использование в качестве модели для человека сchwannoma опухоли. Поэтому мы иллюстрируют упрощенную, воспроизводимое протокол для культуры первичных человеческих VS клеток. Это легко освоен метод позволяет для молекулярных и клеточных исследований, которые более точно воспроизводят сложность заболевания VS.

Introduction

Вестибулярные шванном (VSS) представляют Шванн клетки (СК) опухолей вестибулярного нерва, ущерба 10% всех внутричерепных новообразований ^1-3. VSs произойти в любом спорадических или семейных (нейрофиброматоз типа 2, NF2) формах, как связанных с инактивирующих дефектов в супрессоров опухолей NF2 ген. Лечение VSS, как правило, хирургическая резекция или радиохирургия, однако заболеваемость таких процедур включает глухота, лица невропатии, утечка спинномозговой жидкости, дисбаланс и опухоли отрастания ^1. Кроме того не все пациенты являются приемлемыми хирургические или радиационные кандидатов. Столь значительный заболеваемости, а также отсутствие альтернативных методов лечения загнал расследование уникальной молекулярной биологии VSS в надежде разработке новых методов лечения ^3,4.

Клеточные культуры позволяет быстро, легкому, и углубленного анализа молекулярной и клеточной поведения и скрининга потенциального терапевтического комфунтов. Исторически сложилось так, отсутствие доступа к образцов свежих тканей и тем, что шваннома клетки не увековечена значительно затрудняло использование первичных культур для исследования шваннома опухолей. Чтобы преодолеть ограниченный запас первичных культурах, увековечены клеточная линия HEI193 В.С. был сгенерирован трансдукции ВПЧ Е6 и Е7 онкогенов ^5. Это онкогенного трансдукции внесены существенные молекулярные и фенотипические изменения в клетках, которые ограничивают их использование в качестве модели для опухолей шваннома человека. SC культуры, полученные из трансгенных линий мышей, которые не имеют функциональный ген NF2 представляют другую альтернативу для расследования УХЛ2-зависимую SC туморогенез в пробирке. Эти культуры, однако не в состоянии повторять гетерогенную природу человека VSS или счета для конкретного поведения человека. Большинство предыдущих методы VS культуры требуется относительно длинные сроки обработки и сложных методов селективного культуры ^6-8.Здесь мы представляем простой, воспроизводимый протокол для первичной VS культуре клеток с полной переработки в рамках 3 часов, с 95%-ной чистоты опухолевых клеток, как определяется иммунной окраски.

Protocol

Заявление по этике: использование человеческих образцов опухоли в этом протоколе было одобрено Университета Айовы Institutional Review Board (IRB).

1. Настройка за день до опухоли урожая

1. Пальто Сотовые Культура Пластины: В стерильной капот культуре, добавить достаточно поли-L-орнитин (0,01% раствор), чтобы покрыть дно полистирол / пластической культуры хорошо / блюдо, заменить крышки, и пусть сидят при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 часа. Предметные стекла или покровные может быть заменен на полистирола для экспериментов, требующих визуализации.
2. Через 2 часа, удалить поли-L-орнитин решение с вакуумом и позволяют пластины полностью высохнуть в стерильной культуры капюшонами. Добавьте достаточно решение ламинин (10 мкг / мл в Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-свободный} HBSS [HBSS-/ -]), чтобы полностью покрыть культуральные планшеты, замените крышки, то либо 1) место в холодном 4 ° C холодильнике в течение ночи или 2) разместить в 37 ° C инкубаторе в течение по крайней мере 2 часов. Если плитыбудут сохранены на ночь или дольше, оберните пластины в полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения / высыхание.

2. Настройка День опухоли урожая

1. Подготовка Культура СМИ: Медиа что приготовлено на день урожая и обработки опухоли, хранить при температуре 4 ° С, и нагревают до 37 ° С в инкубаторе непосредственно перед СМИ добавления / изменения.
2. Шваннома культуральные среды является высоким содержанием глюкозы (4,5 мг / мл) DMEM (с фенолового красного) с 0,1 мг / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина; N2 СМИ дополнить конечное разведение 1:100; Бычьего инсулина 5 мкг / мл; Эмбриональной бычьей сыворотки до 10% общего объема. Фильтр все средства массовой информации через 0,22 мкм фильтр.
3. Подготовка Транспортировка образцов Cooler: Отправить фразу заполнено кулер с 1-2 (в зависимости от количества опухоли быть собраны) стерильные 50 мл конические пробирки с 25 мл HBSS с Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) в операционную для передачи образца опухоли и транспорта.
4. Подготовка Individual опухоли диссоциации трубы - разливают в стерильные 2 мл с круглым дном трубки 1 мл HBSS + / + и место на льду. (Трубы будут использованы для резкого рассечение / диссоциации образцов опухоли).
5. Для диссоциации, подготовить около одного диссоциации трубку для каждого 0,5 см ³ заготовленной ткани; например, опухоли образец измерительные 1,0 х 1,0 х 1,0 см (1 см ³⁾ потребуется два ССРХ + / + диссоциации трубки.
6. Ультрафиолетовый свет стерилизации: Место ткани ножницы, небольшие щипцы, скальпель ручка, 1x нормально чашку Петри, P1000 пипетки и наконечники для пипеток в стерильной капот культуры и оставить под ультрафиолетовым светом в течение ~ 15 мин до приезда гостя и обработки ткани опухоли.

3. Образец Выделение и Транспорт

1. Изолировать образцы опухолевых по хирургической резекции.
2. Сразу же место образцы опухолевых в ледяной ССРХ + / + как можно быстрее после снятия с пациента. После того как все Тканье образцы собираются, образцы транспорта (на льду) от оперативного театра в лабораторию для дальнейшей обработки.

4. Ткани Диссоциация и Растирание

1. Следуя стандартной стерильных в ламинаре, принести коническую трубку с образцом опухолевых в капот культуры, и мыть образцы путем обращения трубки и опухоль 50x. Разрешить фрагменты падать на дно пробирки, а затем удалить HBSS + / +. Залейте 30 мл HBSS + / +, и агитировать / инвертировать 50x снова. Повторите удаление инверсия / медиа в общей сложности 4x.
2. Повторное приостановить фрагментов опухоли в 30 мл HBSS + / +, в последний раз, а затем залить смесь в sterile100 мм чашки Петри, и отдельный опухоли в 0,5 см ³ группировок. Если более крупные фрагменты опухоли встречаются, используйте ножницы ткани или скальпель (# 11 или # 15 блейд), чтобы разрезать на мелкие куски.
3. Используйте пинцет, чтобы разместить группы 0,5 см ³ ткани в индивид ССРХ + / + заполнено, 2 мл с круглым дном коническаяаль трубы, все на льду. Используйте ножницы ткани рубить фрагментов опухоли в суб-1 мм фрагменты-подвески должны иметь 'Snowglobe' внешний вид (рис. 1). Фарш опухоли только до тех пор, большинство из фрагментов не являются суб-1 мм; Не 'над-фарш "Образцы опухоли. Поместите полностью фарш ткани трубку обратно на лед, и повторить со всеми дополнительными образцами труб.
4. Перенесите все фрагментированные образцы опухоли в единый 15 мл коническую трубку. P1000 пипетки со стерильным наконечником резки / изменение работает хорошо для этого шага. Используйте дополнительные ССРХ + / +, чтобы смыть / промыть 2 мл диссоциации трубы, чтобы убедиться, что все образцы опухоли была собрана в 15 мл трубки. Спином вниз смесь в центрифуге при 23 ° С, при 73 мкг в течение 5 мин.
5. Всасывания с HBSS + / +, оставив осадок клеток. Повторное приостановить фрагменты в смеси 1:1 0,25% трипсина: 0,2% коллагеназы (растворенного в HBSS-/ -) - добавить достаточно, чтобы держать фрагментов опухоли в тесном суspension. Заменить винт-топ, и место в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин. Перемешайте смесь клеток, по крайней мере один раз во время инкубации, чтобы сохранить фрагменты в виде суспензии. Поместите питательных сред шваннома в инкубатор, чтобы нагреть его в это время, а также.
6. После инкубации 100 мкл FBS в каждую пробирку для инактивации трипсина, а затем образец центрифуге при 23 ° C, 73 мкг в течение 5 мин. С помощью пипетки, тщательно всасывания от столько супернатант, как это возможно, не нарушая осадок клеток. Добавить нагретого культуральной среды (N2/insulin/5% FBS) в опухолевых фрагментов до конечной соотношении 1:02 фрагментов опухоли: культуральные среды (например, если есть 1 мл фрагментов опухоли, добавьте в 2 мл нагревали СМИ).
7. Подготовка к опухоли растиранием, сокращая наконечник от наконечника P1000 пипетки до диаметра примерно 1-2 мм. Медленно растирают клеточной суспензии с помощью постепенно все меньше и меньше советы диаметр пипетки, пока вы не можете легко пипетки раствора через unaltEred P1000 пипетки. Сразу перейти к меньшим кончика, как только вы можете легко пипетки решение опухоли через наконечник - не более растирают образца. Если один больше, кусочек ткани блоков аспирации во время растирания, нажав пипетки на дно конической трубе часто позволяет продолжать растирание.

5. Сотовый Покрытие

1. Один 0,5 мм ³ фрагмент ткани достаточно, чтобы отобрать 1 х 100 мм блюдо, или 4 х 8-well/4-well горки. Просто перед добавлением смеси СМИ / клеток, удалите ламинин раствора из пластин культуры, но не позволяйте планшеты сухой.
2. Для каждого 100 мм блюдо, распустить фрагмент опухоли в 10 мл нагревают культура СМИ.
3. Для каждой лунки слайда 4-а, используйте 750 мкл нагревали культура СМИ (3 мл для всей слайде).
4. Для каждую лунку слайд 8-а, используйте 400 мкл нагревали культура СМИ (3,2 мл для всей слайде).
5. Инкубируют культуры в 37 &# 160; ° C, 100% влажность, 6% СО _2. Оставьте культур в покое в течение по крайней мере 36 часов, а затем изменить носитель если решение пожелтевшей (кислый). В противном случае измените носитель при 72 ч, затем каждые 2-3 дня или когда средства массовой информации стали кислой. Если носитель становится кислой ежедневно в течение нескольких дней подряд, это, как правило признаком возможного бактериального или дрожжевого заражения.

Representative Results

Правильное фрагментации опухоли имеет важное значение для оптимального посева и выроста в чашках для культуры ткани (рис. 1). Идентификация шваннома клеток в течение первых дней после посева часто бывает трудно, из-за затемнения количество продуктов распада клеток и красных кровяных телец. К ^4-й или ^5-й день, расширения клеток вблизи прилипших фрагментов опухоли создаст узнаваемый 'шнуровкой' модели среди обломков. Последующие изменения медиа вообще удалить большинство неадгезивных клеток на второй неделе. С помощью этого метода, 90% слияния можно ожидать между 7-14 дней, в зависимости от начальной жизнеспособности фрагмента опухоли до измельчения и покрытие плотность (рис. 2). Как описано выше, шваннома культуры появляются расти наружу от небольших фрагментов адгезивных фрагментов опухоли ^9,10. Такой результат может быть обнаружено к концу первой недели. Рисунок 2 показывает бrightfield визуализации шваннома нарост клеток от одного фрагмента опухоли, изложенной в красный в правом нижнем углу. Рисунок 3 иллюстрирует "связующей" вырост, который происходит между двумя различными фрагментами опухоли, в культуре скважин иммуноокрашиванию с поликлональной кроличьей анти-S100 антитела. Мы регулярно immunostain культур с анти-S100 или анти-р75 ^NTR антител проверить чистоту культур и точно определить шваннома клетки для анализа (рис. 4). С помощью этих методов более> 95% клеток в этих культурах представляют Шваннома клетки. Шваннома клетки также этикетка с глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) и ErbB2, среди других маркеров ^11.

Рисунок 1. Сравнение том же образце опухоли и до (а) и кормовойэ (В) мясорубки. образец, полученный в 1,5 мл HBSS + / + с фенолового красного в 2,0 мл с круглым дном коническую трубку.

Рисунок 2. Типичный вид культур на микроскопии по методу светлого. Веретенообразной шваннома клеток следствием излучается из фрагмента опухоли, изображение, полученное по культуре 10-й день. Шкала бар = 100 мкм.

Рисунок 3. Иммуноокрашивание первичных вестибулярных культур шваннома с анти-S100 антитела демонстрируя типичный культуру и клеточной морфологии. А) вид низкой мощности, иллюстрирующий результат от металлизированными фрагментов опухоли, культуры 14-й день Масштаб. Бар = 200 мкм. B) Высшее военнопленныхэ вид шваннома клеток с веретенообразной морфологии, культуры день 14. Шкала бар = 100 мкм.

Рисунок 4. Иммуноокрашивание первичных вестибулярных культур шваннома для подтверждения чистоты культуры и самобытности клеток. А) Культуры иммуноокрашиванию с анти-S100 антител. Ядра помечены DAPI. Шкала бар = 100 мкм. B) Культур иммуноокрашиванию с анти-р75 ^NTR антител. Ядра помечены DAPI. Шкала бар = 100 мкм.

Discussion

История в пробирке шваннома культур

Усилия по созданию в пробирке культур шваннома начал всего несколько десятилетий после первоначального невриномы слухового нерва открытая хирургическая резекция произошло в 1894 ^12. Первые записанные культуры были на Кредель в 1920, который безуспешно пытались расти фарш опухоль на "висит капельным методом" ¹² . Позже, д-ра. Мюррей и Стаут опубликовал свой ​​опыт культуры в пробирке с neurilemomas выращенных на свернувшейся плазмы крови человека. Интересно, что эта техника показала, что Антони А и Антони B конкретные фрагменты вырос по-разному, с уникальными клеточной морфологии и дифференциальных ставок агар сжижения ^13. Cravioto и Локвуд опубликованы дальнейшие наблюдения культур акустической невриномы в птичьих сгустков на покровного стекла промахи и роликовых труб. Они также были первыми в использовании Rose камеры для покадровой съемки роста опухоли 10. Баур объединил 'целиком' и однослойные подходы в ее публикации, которая также продемонстрировали митогенные эффекты ламинином покрытием пластин культуры ^9. Большинство последующих опубликованные протоколы, как и наш, использовать подобный протокол посева фарш фрагментов опухоли на культуры обрабатываемой поверхности с заряженной аминокислотой (поли-L-орнитин, поли-L-лизина) и подготовки ламинином ^8. Мы использовали этот же метод для культуры шванномы вытекающих из лицевого, тройничного, блуждающего нерва и спинномозговых нервов с аналогичными результатами.

Преимущества вестибулярного Шваннома первичных культурах

Исследования человеческого шваннома опухолей часто используют однородные увековечены клеточных линий и трансгенных моделей мышей. Такие инструменты являются полезными, но го совсем точно отражает генотипы, фенотипы и сложность человеческих болезней. С другой стороны, первичные культуры вероятно обеспечить более реалистичную модель. Они более точно воспроизводят гетерогенность геномной и молекулярной статуса, связанного с опухолей человека ^15.

Чистоту шваннома культур

Задача первичной культуры ткани является поддержание чистоты клеток-мишеней. Шванномы подавляющем большинстве состоят из опухолевых клеток Шванн ^6, однако культур не защищены от загрязнения фибробластов. Исторически сложилось так, методы оптимизации падение шваннома клеток чистоты на три категории: 1) отбор по химически определенной среде и специфических факторов роста; 2) иммуноочистки (например, с магнитной сортировки клеток шарик ^7), 3) сочетание обоих предыдущих методов. По нашему опыту фибробласты или других не-шваннома клетки обычно содержат менее 5% клеток в Cultuповторно, независимо от пациента характеристик (возраст, пол), спорадические или УХЛ2-связанные опухоли, первичной или вторичной резекции опухоли или кистозные против солидных опухолей. Если фибробласты по всей видимости, взяв на себя культуры, удаление сыворотки в течение 1-2 смены носителя позволит значительно снизить это население без ущерба выживание шваннома клеток. Предварительно обработки поверхностей культуре клеток ламинином также облегчает рост шваннома клеток ^9. Минимальный пассажи культур также помогает уменьшить нежелательные сотовой загрязнения - cryostorage лучше завершен в течение первых двух пассирования культуры и культуры эксперименты не рекомендуется за проход 4-5. Мы находим оптимальные результаты при культура экспериментирование завершается прохождения 1-2 с не cryostored клеток.

Мы используем как иммуноокрашивания (анти-S100, DAPI) и микроскопических появление клеточной и ядерной морфологии как меры контроля качества в наших шваннома культур. Иногда этополезно immunostain подмножество культур для моноцитов (CD68) или фибробластов специфических маркеров для дальнейшего проверить чистоту культуры ^9. Во время экспериментального анализа поведения клеток (например, оружия или гибели клеток), мы всегда immunostain с анти-S100 или анти-р75 ^NTR антител проверить, что выводы шваннома клеток конкретных.

Культура морфология и рост клеток

Культуры опухолевых Шваннома обычно отображают уникальные модели роста напоминает Антонио А (высокой плотности клеток, плотно организованы, признаки Verocay образований тела) и редко Антони B (сравнительно редкие ядра, обильные клеточные процессы, менее организация) модели видели в гистопатологии резецированной шванномы опухоли ^16. Почти все шваннома клетки отображения классический длинный, растягивался, биполярное форму клеток, связанный как с Шванн и шваннома клеток ^6,17 однако другие мобильные морфоLogies, как описано Cravioto (амебоидных Микроглия-подобных клеток, веретенообразных клеток, рэкет-формы клеток, а Кайт формы клеток) иногда встречаются ^14. В целом, рост клеток и пролиферация очень медленно в нашей базовой среды (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 дополнения). Добавление известными митогенных факторов, таких как форсколин и β1-нейрегулина значительно увеличивает пролиферацию клеток ^18.

Критические шаги протокола

Наш протокол культура шваннома ткань простой и довольно прощать; Однако есть несколько ключевых шагов, которые обеспечивают успех. Во-первых, корректная обработка опухоли имеет решающее значение. Лучшие результаты получаются, когда опухоль находится непосредственно в ледяную HBSS + / +, как можно скорее после удаления из пациента. Это противоречит обычной хирургической практике сбора удаленной опухоли в то стерильного физиологического раствора отправки совокупную ткани для обработки в патологии в конце корпуса. Во-вторых, держать тканей SAMPле так круто, как это возможно во время обработки. Очень важно, что резекция опухоли сохраняется ледяной, и что обработка происходит в целесообразно, насколько это возможно после удаления. Делай, как большая часть обработки ткани, как это возможно на льду, а также. В-третьих, активно мыть образцы опухоли. Это помогает снизить риск бактериального или дрожжевого заражения. В-четвертых, не чрезмерно сладкие опухолевые образцы. Опухоль растирание зависит от полу-субъективной оценки, когда продолжить с меньшим диаметром кончика пипетки P1000.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components