Summary
الدهليزي Schwannomas (VSS) هي أورام غير خبيثة من خلية شوان (SC) الأصل، ويرتبط مع طفرات في الجينات الكابتة للورم NF2. نحن الإبلاغ عن استنساخه، بروتوكول فعالة لالإنسان الأساسية VS ثقافة الخلية التي تسمح للتلاعب التجريبية الجزيئية والخلوية والتحليل ويلخص طبيعة غير متجانسة من الأمراض التي تصيب البشر.
Abstract
schwannomas الدهليزي (VSS) تمثل خلية شوان (SC) أورام العصب الدهليزي، المساومة 10٪ من جميع الأورام داخل الجمجمة. VSS تحدث في (نوع الورم العصبي الليفي 2، NF2) أشكال إما متفرقة أو العائلية، سواء المرتبطة تعطيل عيوب في الكابتة للورم NF2 الجينات. العلاج لVSS عموما استئصال الجراحي أو الشعاعية، ولكن الاعتلال مثل هذه الإجراءات قد قاد التحقيقات في علاجات أقل الغازية. تاريخيا، وعدم الحصول على عينات أنسجة جديدة، وحقيقة أن الخلايا شفاني لا خلد أعاقت بشكل كبير من استخدام الثقافات الأولية للتحقيق في شفاني تكون الأورام. للتغلب على إمدادات محدودة من الثقافات الأولية، تم إنشاء خط الخلية HEI193 VS خلده تنبيغ مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 E7 والجينات المسرطنة. أدخلت هذه التعديلات أنكجنيك تنبيغ الجزيئية والمظهري كبيرة في الخلايا، والتي تحد من استخدامها كنموذج ليالي الإنسانالأورام chwannoma. وبالتالي فإننا توضيح مبسط، بروتوكول استنساخه لثقافة الإنسان الأساسية VS الخلايا. يتقن هذه التقنية بسهولة يسمح للتحقيقات الجزيئية والخلوية التي ألخص أكثر دقة تعقيد المرض VS.
Introduction
schwannomas الدهليزي (VSS) تمثل خلية شوان (SC) أورام العصب الدهليزي، المساومة 10٪ من جميع الأورام داخل الجمجمة 1-3. VSS تحدث في (نوع الورم العصبي الليفي 2، NF2) أشكال إما متفرقة أو العائلية، سواء المرتبطة تعطيل عيوب في الكابتة للورم NF2 الجينات. العلاج لVSS عموما استئصال الجراحي أو الشعاعية، ولكن الاعتلال مثل هذه الإجراءات تشمل الصمم، واعتلال الأعصاب في الوجه، وتسرب السائل الشوكي، وعدم التوازن، وإعادة نمو الورم 1. بالإضافة إلى ذلك ليس كل المرضى المرشحين الجراحية أو الإشعاع مقبولة. مثل قسط كبير من المراضة وكذلك عدم وجود العلاجات البديلة قد قاد التحقيق في البيولوجيا الجزيئية فريدة من VSS أملا في تطوير علاجات جديدة 3،4.
يسمح زراعة الخلايا لتحليلها السريع، السهل، ومتعمقة للسلوك الجزيئية والخلوية وفحص كوم العلاجية المحتملةجنيه. تاريخيا، وعدم الحصول على عينات أنسجة جديدة، وحقيقة أن الخلايا شفاني لا خلد أعاقت بشكل كبير من استخدام الثقافات الأولية للتحقيق في شفاني تكون الأورام. للتغلب على إمدادات محدودة من الثقافات الأولية، تم إنشاء خط الخلية HEI193 VS خلده تنبيغ مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 E7 والجينات المسرطنة 5. أدخلت هذه التعديلات أنكجنيك تنبيغ الجزيئية والمظهري كبيرة في الخلايا، والتي تحد من استخدامها كنموذج للأورام شفاني الإنسان. SC الثقافات المستمدة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى الجين NF2 وظيفية تمثل بديلا آخر للتحقيق NF2 التي تعتمد SC تكون الأورام في المختبر. ولكن هذه الثقافات تفشل في ألخص طبيعة غير متجانسة من VSS الإنسان أو حساب لسلوك معين الإنسان. معظم تقنيات الثقافة VS السابقة المطلوبة أوقات المعالجة طويلة نسبيا ومعقدة تقنيات ثقافة انتقائية 6-8.هنا نقدم، بروتوكول بسيط لاستنساخه الأولية VS ثقافة الخلية مع معالجة كاملة في أقل من 3 دقائق، مع 95٪ النقاء الخلية السرطانية على النحو الذي يحدده المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على استخدام العينات السرطانية البشرية في هذا البروتوكول من قبل جامعة ولاية ايوا مجلس المراجعة المؤسسية (IRB): بيان الأخلاق.
1. إعداد قبل يوم ورم الحصاد
- معطف الخليوي لوحات الثقافة: في غطاء الثقافة العقيمة، وإضافة ما يكفي من بولي-L-الأورنيثين (0.01٪ الحل) لتغطية الجزء السفلي من ثقافة البوليسترين / البلاستيك جيدا / طبق، استبدال الأغطية، وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل 2 ساعة. الشرائح الزجاجية أو coverslips يمكن أن تكون بديلا عن البوليسترين للتجارب التي تتطلب التصوير.
- بعد 2 ساعة، وإزالة-L-الأورنيثين بولي حل مع الشفط والسماح لوحات لتجف تماما في اغطية الثقافة العقيمة. إضافة ما يكفي من حل laminin (10 ميكروغرام / مل في كا 2 + / 2 ملغ + خالية HBSS [HBSS / -]) لتغطية كامل لوحات والثقافة، واستبدال الأغطية، ثم إما 1) في مكان بارد 4 ° C الثلاجة بين عشية وضحاها، أو 2) وضع في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. إذا لوحاتسيتم تخزين بين عشية وضحاها أو أطول، والتفاف على لوحات في غلاف بلاستيكي لمنع التبخر / جفاف.
2. الإعداد يوم ورم الحصاد
- إعداد الثقافة وسائل الإعلام: يرصد وسائل الاعلام الطازج في يوم الحصاد الورم ومعالجة وتخزينها في 4 درجات مئوية، ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة مباشرة قبل وسائل الإعلام الإضافات / التغييرات.
- وسائل الإعلام ثقافة شفاني مرتفع الجلوكوز (4.5 ملغ / مل) DMEM (مع الفينول الحمراء) مع 0.1 ملغ / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل الستربتوميسين؛ وسائل الإعلام N2 تكملة التخفيف النهائية 1:100؛ الأنسولين البقري 5 ميكروغرام / مل؛ مصل بقري جنيني إلى إجمالي حجم 10٪. تصفية جميع وسائل الإعلام من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
- تحضير العينة النقل المبردة: ارسال برودة الجليد مليئة 1-2 (اعتمادا على كمية من الورم ليتم حصادها) العقيمة أنابيب مخروطية 50 مل مع 25 مل HBSS مع كا 2 + / + 2 ملغ (HBSS + / +) الى غرفة العمليات لنقل عينة الورم والنقل.
- إعداد فرديidual أنابيب الورم تفارق - ملء العقيمة 2 مل جولة أنابيب أسفل مع 1 مل من HBSS + / + ومكان على الجليد. (سوف تستخدم أنابيب للتشريح حادة / تفكك عينات الورم).
- لتفارق، وإعداد ما يقرب من أنبوب تفارق لكل 0.5 سم 3 من الأنسجة التي تحصد؛ على سبيل المثال، سوف عينة الورم قياس 1.0 × 1.0 × 1.0 سم (1 سم 3) تتطلب اثنين HBSS أنابيب + / + التفكك.
- تعقيم الأشعة فوق البنفسجية: مقص مكان الأنسجة، ملقط صغير، والتعامل مع مشرط، 1X طبق بتري العادية، P1000 ماصة، ونصائح ماصة في غطاء الثقافة العقيمة، وترك تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ل~ 15 دقيقة قبل الوصول وتجهيز نسيج الورم.
3. عينة عزل والنقل
- عزل عينات الورم عن طريق استئصال الجراحي.
- وضع على الفور عينات الورم في HBSS الجليد الباردة + / + في أسرع وقت ممكن بعد إزالة من المريض. مرة واحدة كل TISSUيتم جمع عينات ه، وعينات النقل (على الجليد) من المسرح المنطوق إلى المختبر لمزيد من المعالجة.
4. تفارق الأنسجة وسحن
- التالية تقنية معقمة القياسية في غطاء تدفق الصفحي، وجلب أنبوب مخروطي مع عينة الورم في غطاء محرك السيارة والثقافة، وغسل العينات بواسطة قلب الأنبوب والورم 50X. تسمح شظايا في الانخفاض إلى أسفل الأنبوب، ثم إزالة HBSS + / +. إعادة ملء مع 30 مل HBSS + / +، وتستنهض الهمم / عكس 50X مرة أخرى. تكرار إزالة انعكاس / وسائل الإعلام ليصبح المجموع 4X.
- اعادة تعليق شظايا الورم في 30 مل HBSS + / + للمرة الأخيرة، ثم صب الخليط في طبق بتري ملم sterile100، والورم منفصلة إلى 0.5 سم 3 مجموعات. إذا واجهت شظايا الورم أكبر، استخدم مقص أو مشرط الأنسجة (# 11 أو # 15 شفرة) لمقطعة إلى قطع أصغر.
- استخدام ملقط لوضع مجموعات الأنسجة 0.5 سم 3 في الفرد HBSS + / + شغلها، 2 مل أسفل الجولة مخروطيأنابيب القاعدة وكل على الجليد. استخدام مقص لتخطر على الأنسجة السرطانية في أجزاء الفرعية 1 ملم شظايا-تعليق ينبغي أن يكون لها مظهر 'سنوجلوب' (الشكل 1). تخطر على الورم فقط حتى الغالبية العظمى من شظايا هي الفرعية 1 مم؛ لا 'أكثر من اللحم المفروم' عينات الورم. وضع أنبوب الأنسجة المفروم تماما مرة أخرى على الجليد، وكرر مع جميع أنابيب عينة إضافية.
- نقل جميع عينات الورم مجزأة إلى واحدة 15 مل أنبوب مخروطي. ماصة P1000 مع خفض / تعديل غيض العقيمة يعمل بشكل جيد لهذه الخطوة. استخدام اضافية HBSS + / + لطرد / شطف 2 مل تفارق أنابيب للتأكد من تم جمع كل عينة الورم في أنبوب 15 مل. تدور باستمرار الخليط في أجهزة الطرد المركزي في 23 درجة مئوية، في 73 x ج لمدة 5 دقائق.
- شفط قبالة HBSS + / +، وترك بيليه الخلية. اعادة تعليق شظايا في 1:01 خليط من 0.25٪ التربسين: 0.2٪ كولاجيناز (الذائبة في HBSS / -) - إضافة ما يكفي فقط للحفاظ على شظايا الورم في ضيق سوspension. استبدال المسمار العلوي، ووضعه في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تستنهض الهمم خليط الخلية مرة واحدة على الأقل خلال فترة الحضانة للحفاظ على شظايا في التعليق. وضع وسائل الإعلام ثقافة شفاني في حاضنة دافئة لأنه في هذا الوقت أيضا.
- بعد الحضانة، وإضافة 100 ميكرولتر FBS إلى كل أنبوب لإبطال نشاط التربسين، ثم عينة الطرد المركزي في 23 درجة مئوية، 73 x ج لمدة 5 دقائق. باستخدام ماصة، شفط بعناية قبالة بقدر طاف ممكن من دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة سائل الإعلام والثقافة الدفء (N2/insulin/5٪ FBS) إلى شظايا الورم إلى نسبة 1:2 النهائية شظايا الورم: وسائل الإعلام والثقافة (على سبيل المثال، إذا كان هناك 1 مل من شظايا الورم، إضافة في 2 مل من درجة حرارة وسائل الإعلام).
- الاستعداد للورم سحن عن طريق خفض غيض الخروج من غيض ماصة P1000 ليبلغ قطرها حوالي 1-2 مم. يسحن ببطء تعليق الخلية باستخدام نصائح تدريجيا أصغر وأصغر قطرها ماصة، حتى يمكنك بسهولة ماصة الحل من خلال unaltالدو P1000 ماصة. على الفور انتقل إلى تلميح أصغر مرة واحدة يمكنك بسهولة ماصة الحل الورم من خلال طرف - لا يسحن على العينة. إذا قطعة واحدة من أكبر كتل الأنسجة الطموح خلال سحن، والتنصت غيض ماصة على الجزء السفلي من الأنبوب المخروطية غالبا ما يسمح استمرار سحن.
5. الخليوي تصفيح
- واحد 0.5 مم 3 جزء من الأنسجة غير كافية لبذر 1 × 100 مم طبق، أو 4 × الشرائح 8-well/4-well. فقط قبل إضافة خليط سائل الإعلام / خلية، وإزالة حل laminin من لوحات الثقافة ولكن لا تدع لوحات الجافة.
- لكل 100 ملم طبق، ويحل جزء الورم في 10 مل تحسنت سائل الإعلام والثقافة.
- لكل بئر من الشريحة 4 جيدا، استخدم 750 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة الدفء (3 مل للشريحة كاملة).
- لكل بئر من الشريحة 8 جيدا، استخدم 400 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة الدفء (3.2 مل للشريحة كاملة).
- احتضان الثقافات في 37 و# 160؛ درجة مئوية، الرطوبة 100٪، 6٪ CO 2. مغادرة الثقافات وحدها لمدة 36 ساعة على الأقل، ثم قم بتغيير وسائل الإعلام إذا تم المصفرة الحل (الحامضية). خلاف ذلك تغيير وسائل الإعلام في 72 ساعة، ثم كل 2-3 أيام، أو عندما تصبح وسائل الإعلام الحمضية. إذا أصبحت وسائل الإعلام حمضية يوميا لعدة أيام متتالية، وهذا هو عادة مؤشرا على التلوث الجرثومي أو الخميرة المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تفتيت الورم الصحيح هو ضروري لبذر الأمثل وثمرة في أطباق زراعة الأنسجة (الشكل 1). تحديد الخلايا شفاني خلال الأيام الأولى بعد الطلاء غالبا ما يكون صعبا، وذلك بسبب حجب كميات من الحطام الخلوية وخلايا الدم الحمراء. قبل عشر 4 أو اليوم ال 5، وملحقات خلية بالقرب من شظايا الورم ملتصق خلق معترف بها 'جلد' أنماط من بين الحطام. التغييرات اللاحقة إزالة وسائل الإعلام عموما غالبية الخلايا غير ملتصقة في الأسبوع الثاني. باستخدام هذه الطريقة، 90٪ التقاء يمكن توقع بين 7-14 يوما، وهذا يتوقف على حيوية أولي للجزء الورم قبل تنميق وطلاء الكثافة (الشكل 2). كما هو موضح سابقا، ويبدو أن تنمو الثقافات شفاني الخارج من شظايا صغيرة من شظايا الورم ملتصق 9،10. مثل ثمرة قابلا للاكتشاف بحلول نهاية الأسبوع الأول. ويبين الشكل 2 بالتصوير rightfield من شفاني ثمرة من خلية الورم جزء واحد، والمبينة باللون الأحمر في الزاوية اليمنى السفلى. الشكل 3 يوضح 'سد' ثمرة التي تحدث بين اثنين من شظايا الورم مختلفة، في آبار الثقافة immunostained مع الأرنب بولكلونل مكافحة S100 الأجسام المضادة. نحن immunostain بشكل روتيني مع الثقافات المضادة للS100 أو المضادة للأضداد P75 NTR للتحقق من نقاء الثقافات وإيجابية تحديد الخلايا شفاني للتحليل (الشكل 4). مع هذه الأساليب أكثر من> 95٪ من الخلايا في هذه الثقافات وتمثل خلايا ورم شفاني. خلايا ورم شفاني تسمية أيضا مع الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) وERBB2، من بين علامات أخرى 11.
الشكل 1. مقارنة بين عينة الورم نفسه سواء قبل (A) والخلفإيه (B) تنميق. عينة أعدت في 1.5 مل HBSS + / + مع الفينول الأحمر في 2.0 مل أنبوب مخروطي جولة القاع.
الشكل 2. مظهر نموذجي للثقافات على brightfield المجهري. يشع Spindled ثمرة خلية الورم ورم شفاني من جزء، الصورة التي اتخذت في يوم الثقافة 10. شريط مقياس = 100 ميكرون.
الرقم 3. المناعية الثقافات شفاني الدهليزي الابتدائي مع الأجسام المضادة للS100 مما يدل على ثقافة نموذجية والأشكال التضاريسية الخلية. أ) عرض منخفضة الطاقة توضح ثمرة من شظايا الورم مطلي، يوم الثقافة 14. مقياس بار = 200 ميكرون. B) الأسرى العاليعرض إيه من خلايا ورم شفاني مع التشكل spindled، يوم الثقافة 14. مقياس بار = 100 ميكرون.
الرقم 4. المناعية الثقافات شفاني الدهليزي الابتدائي لتأكيد نقاء الثقافة والهوية الخلية. A) immunostained الثقافات مع الأجسام المضادة للS100. وصفت نوى مع دابي. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. B) الثقافات immunostained مع anti-P75 NTR الأجسام المضادة. وصفت نوى مع دابي. مقياس شريط = 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تاريخ الثقافات في المختبر شفاني
بدأت الجهود الرامية إلى إنشاء المختبر في الثقافات شفاني فقط بضعة عقود بعد بأورام في العصب السمعي الأولي وقعت استئصال الجراحي المفتوحة في عام 1894 12. كانت الثقافات سجلت أول من Kredel في 1920s، الذي حاول دون جدوى أن ينمو الورم المفروم بواسطة "طريقة الشنق قطرة" 12 . في وقت لاحق، الدكاترة. موراي وستاوت نشرت في المختبر الثقافة التجربة مع neurilemomas نمت على البلازما البشرية متخدر. ومن المثير للاهتمام، وكشفت هذه التقنية أن أنتوني أنتوني ألف وباء شظايا محددة نمت بشكل مختلف، مع مورفولوجيا الخلوية والتفضيلية معدلات فريدة من أجار تسييل 13. Cravioto ووكوود نشرت مزيدا من الملاحظات من الثقافات بأورام في العصب السمعي في جلطات الطيور على زلات ساترة والأنابيب الدوارة. وكانوا أيضا أول من استخدم غرف روز للالوقت الفاصل بين التصوير من نمو الورم
فوائد الثقافات الدهليزي شفاني الابتدائية
دراسات من تكون الأورام شفاني الإنسان غالبا ما تستخدم خطوط الخلايا مخلد متجانسة ونماذج الفئران المعدلة وراثيا. هذه الأدوات هي مفيدة ولكن دس لا تعكس بدقة المورثات، الظواهر، وتعقيد الأمراض التي تصيب البشر. على النقيض من ذلك، من المرجح الثقافات الأولية تقدم نموذجا أكثر واقعية. أنها أكثر بأمانة ألخص عدم تجانس الوضع الجيني والجزيئي المرتبطة الأورام البشرية 15.
نقاء الثقافات شفاني
وثمة تحد من زراعة الأنسجة الأساسي هو الحفاظ على نقاء الهدف الخلية. Schwannomas تتكون من الخلايا الورمية بأغلبية ساحقة شوان 6، ولكن الثقافات ليست في مأمن من التلوث الليفية. تاريخيا، وأساليب لتحسين نقاء شفاني خلية تنقسم إلى ثلاث فئات: 1) اختيار بعوامل نمو محددة متوسطة محددة كيميائيا و؛ 2) immunopurification (على سبيل المثال، مع خلية حبة المغناطيسي فرز 7)، 3) مزيج من كل من الأساليب السابقة. في تجربتنا تتكون الخلايا الليفية أو خلايا غير شفاني الأخرى عموما أقل من 5٪ من الخلايا في cultuإعادة، بغض النظر عن خصائص المريض (العمر، الجنس)، وأورام متفرقة أو NF2 المرتبطة، الابتدائية أو الثانوية استئصال الورم، أو الكيسي مقابل أنواع الأورام الصلبة. إذا تظهر الخلايا الليفية إلى أن الاستيلاء على الثقافة، وإزالة المصل لمدة 1-2 التغييرات الوسائط تقلل إلى حد كبير هذه الفئة من السكان دون أن يؤثر ذلك سلبا على بقاء الخلية شفاني. قبل معالجة السطوح زراعة الخلايا مع laminin يسهل أيضا نمو الخلايا شفاني 9. الركض الحد الأدنى من الثقافات يساعد أيضا على تقليل التلوث الخلوية غير المرغوب فيه - هو أفضل الانتهاء cryostorage ضمن أول اثنين من الممرات والثقافة، وليس من المستحسن ثقافة التجريب وراء مرور 4-5. نجد أفضل النتائج عند اكتمال ثقافة التجريب قبل مرور 1-2 مع الخلايا غير cryostored.
نستخدم كلا المناعية (المضادة للS100، دابي) والمظهر المجهري للمورفولوجيا الخلوية والنووية باعتبارها تدابير مراقبة الجودة في الثقافات شفاني لدينا. في بعض الأحيان أنهامن المفيد أن immunostain مجموعة فرعية من الثقافات لالوحيدات (CD68) أو علامات محددة الخلايا الليفية إلى مزيد من التحقق الثقافة نقاء 9. خلال التحليلات التجريبية من سلوك الخلية (على سبيل المثال، والانتشار أو موت الخلية)، ونحن دائما مع immunostain مكافحة S100 أو المضادة للأضداد P75 NTR للتحقق من أن النتائج هي شفاني خلية معينة.
ثقافة التشكل والنمو أنماط
عادة عرض الثقافات ورم شفاني أنماط النمو فريدة تذكرنا أنتوني A (كثافة الخلايا عالية، نظمت بإحكام والبيانات من تشكيلات هيئة فيروكاي) ونادرا من أنتوني ب (نوى متفرق نسبيا، العمليات الخلوية وفيرة، وأقل المنظمة) أنماط المشاهدة في التشريح المرضي من شفاني مقطوعة الأورام 16. خلايا ورم شفاني ما يقرب من جميع عرض طويل، spindled، شكل الخلية القطبين الكلاسيكية المرتبطة مع كل من شوان والخلايا شفاني 6،17 بيد أخرى مورفو الخليةlogies، كما وصفها Cravioto (الخلايا الدبقية الصغيرة مثل أميبية، خلايا المغزل على شكل، خلايا على شكل مضرب، وخلايا طائرة ورقية على شكل) أحيانا تحدث 14. عموما، نمو الخلايا وانتشارها بطيئة جدا في منطقتنا المتوسطة قاعدة (DMEM/10٪ FBS/Insulin/N2 الملحق). بالإضافة إلى ذلك من العوامل المعروفة مولد للتفتل مثل forskolin وβ1-neuregulin يزيد بشكل ملحوظ انتشار الخلايا 18.
خطوات حاسمة البروتوكول
لدينا بروتوكول زراعة الأنسجة شفاني بسيط ومتسامح إلى حد ما؛ ولكن هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي تضمن النجاح. أولا، التعامل مع الورم الصحيح أمر بالغ الأهمية. نتوقع أفضل النتائج عندما يتم وضع الورم مباشرة في الجليد الباردة HBSS + / + في أقرب وقت ممكن إزالة مرة واحدة من المريض. هذا يتعارض مع الممارسة الجراحية المعتادة لجمع الورم مقطوعة في ملحي معقم ثم ارسال النسيج الكلي للتجهيز في علم الأمراض في نهاية هذه القضية. الثانية، والحفاظ على الأنسجة عصيدةليه بارد قدر الإمكان أثناء معالجة. فمن الأهمية بمكان أن الورم مقطوعة يتم الاحتفاظ الجليد الباردة، ويحدث أن معالجة بأقصى سرعة ممكنة بعد إزالة. كما يفعل الكثير من معالجة الأنسجة ممكن على الجليد كذلك. الثالث، وغسل بقوة عينات الورم. هذا يساعد في تقليل خطر التلوث الجرثومي أو الخميرة. الرابع، لا أكثر من اللحم المفروم عينات الورم. الورم سحن يعتمد على تقييم شبه شخصي لمتى على تواصل مع أصغر قطرها P1000 ماصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أي تضارب في المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
الدعم: NIDCD R01DC009801، P30DC010362، 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
