Summary
Vestibulaire Schwannomas (VSS) niet-maligne tumoren van Schwann-cellen (SC) oorsprong, geassocieerd met mutaties in het NF2 tumor suppressor gen. Wij rapporteren een reproduceerbare, efficiënt protocol voor primaire menselijke VS celcultuur die het mogelijk maakt voor moleculaire en cellulaire experimentele manipulatie en analyse en recapituleert de heterogene aard van de ziekte bij de mens.
Abstract
Vestibulaire schwannomen (VSS) vertegenwoordigen Schwann-cellen (SC) tumoren van de vestibulaire zenuw, afbreuk te doen aan 10% van alle intracraniële tumoren. VSen zich ofwel sporadische of familiaire (neurofibromatose type 2, NF2) vormen, zowel in verband met het inactiveren van defecten in het NF2 tumor suppressor gen. Behandeling voor VSen is over het algemeen chirurgische resectie of radiochirurgie, maar de morbiditeit van deze procedures heeft onderzoek gedreven in minder invasieve behandelingen. Historisch gezien zijn gebrek aan toegang tot verse weefselmonsters en het feit dat schwannoma cellen niet worden vereeuwigd aanzienlijk bemoeilijkt het gebruik van primaire kweken voor onderzoek schwannoma het ontstaan van tumoren. Om het beperkte aanbod van primaire culturen te overwinnen, werd het vereeuwigd HEI193 VS cellijn gegenereerd door transductie met HPV E6 en E7 oncogenen. Deze oncogene transductie ingevoerd significante moleculaire en fenotypische veranderingen aan de cellen die het gebruik als een model voor humane grenswaardechwannoma tumoren. We illustreren dus een vereenvoudigde, reproduceerbare protocol voor cultuur van primaire menselijke cellen VS. Dit gemakkelijk onder de knie techniek maakt het mogelijk voor moleculaire en cellulaire onderzoeken die nauwkeuriger recapituleren de complexiteit van de ziekte VS.
Introduction
Vestibulaire schwannomen (VSS) vertegenwoordigen Schwann-cellen (SC) tumoren van de vestibulaire zenuw, afbreuk te doen aan 10% van alle intracraniële neoplasmata 1-3. VSen zich ofwel sporadische of familiaire (neurofibromatose type 2, NF2) vormen, zowel in verband met het inactiveren van defecten in het NF2 tumor suppressor gen. Behandeling voor VSen is over het algemeen chirurgische resectie of radiochirurgie, maar de morbiditeit van dergelijke procedures omvat doofheid, gezichts neuropathieën, weglekken van ruggenmergvloeistof, onbalans, en tumor hergroei 1. Bovendien niet alle patiënten zijn aanvaardbaar chirurgische of straling kandidaten. Dergelijke significante morbiditeit en een gebrek aan alternatieve therapieën heeft onderzoek gedreven in de unieke moleculaire biologie van VSen in de hoop op het ontwikkelen van nieuwe behandelingen 3,4.
Celcultuur zorgt voor een snelle, gemakkelijke en grondige analyse van de moleculaire en cellulaire gedrag en screening van potentiële therapeutische compond. Historisch gezien zijn gebrek aan toegang tot verse weefselmonsters en het feit dat schwannoma cellen niet worden vereeuwigd aanzienlijk bemoeilijkt het gebruik van primaire kweken voor onderzoek schwannoma het ontstaan van tumoren. Om het beperkte aanbod van primaire culturen te overwinnen, werd het vereeuwigd HEI193 VS cellijn gegenereerd door transductie met HPV E6 en E7 oncogenen 5. Deze oncogene transductie ingevoerd significante moleculaire en fenotypische veranderingen aan de cellen die het gebruik als een model voor humane schwannoma tumoren beperken. SC cultures afgeleid van transgene muizen lijnen die een functioneel gen missen NF2 vormen een alternatief voor NF2-afhankelijke SC tumorigenese in vitro onderzoeken. Deze culturen niet echter aan de heterogene aard van de menselijke VSen of account voor menselijke specifiek gedrag recapituleren. De meeste vorige VS cultuur technieken die nodig zijn relatief lange doorlooptijden en ingewikkeld selectieve kweektechnieken 6-8.Hier presenteren we een eenvoudige, reproduceerbare protocol voor primaire VS celkweek met volledige verwerking in minder dan 3 uur, met 95% tumorcel zuiverheid, zoals bepaald door immunostaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: het gebruik van de menselijke specimens tumor in dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Iowa Institutional Review Board (IRB).
1. Stel de Day Before Tumor Harvest
- Coat celkweekplaten: In een steriele cultuur kap, voeg genoeg poly-L-ornithine (0,01% oplossing) aan de onderkant van een polystyreen / plastic cultuur en / schotel dekken, vervang de deksels en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur. Glasplaten of dekglaasjes kan worden vervangen voor polystyreen voor experimenten die beeldvorming.
- Na 2 uur, verwijder de poly-L-ornithine oplossing afzuigen en laat de platen volledig drogen in een steriele cultuur kappen. Voeg genoeg laminine-oplossing (10 ug / ml in Ca2 + / Mg2 +-vrij HBSS [HBSS-/ -]) volledig te bedekken de kweekplaten, vervangen deksels, vervolgens 1) plaats in koel 4 ° C koelkast overnacht, of 2) plaatsen 37 ° C incubator gedurende ten minste 2 uur. Als platenzal 's nachts of langer worden bewaard, wikkel de platen in plastic folie om verdamping / uitdroging te voorkomen.
2. Stel de Dag van de Tumor Harvest
- Bereid Culture Media Media is vers op de dag van tumor oogst en verwerking gemaakt, opgeslagen bij 4 ° C en verwarmd tot 37 ° C incubator onmiddellijk voor media aanvullingen / wijzigingen.
- Schwannoom kweekmedia hoog-glucose (4,5 mg / ml) DMEM (met fenolrood) met 0,1 mg / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine; N2 media vullen uiteindelijke verdunning 1:100; Runderinsuline 5 ug / ml; Fetal Bovine Serum 10% totale volume. Filter alle media door 0,22 urn filter.
- Bereid Specimen Transport Cooler: Stuur een ijs gevulde koelbox met 1-2 (afhankelijk van de hoeveelheid tumor te oogsten) steriele 50 ml conische buizen met 25 ml HBSS met Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) naar de operatiekamer voor tumormonster overdracht en transport.
- Bereid individual tumor dissociatie buizen - vul steriel 2 ml ronde bodem buizen met 1 ml HBSS + / + en leg ze op ijs. (Buizen worden gebruikt voor scherpe dissectie / dissociatie van tumormonsters).
- Voor dissociatie, bereiden ongeveer een dissociatie buis voor elke 0,5 cm 3 van verzamelde weefsel; bijvoorbeeld een tumor proefstuk van 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm3) twee HBSS + / + dissociatie buizen nodig.
- Ultraviolet licht sterilisatie: Plaats weefsel schaar, kleine pincet, scalpel handvat, 1x normaal petrischaal, P1000 pipet en pipet tips in een steriele cultuur kap, en laat onder ultraviolet licht voor ~ 15 minuten voor aankomst en verwerking van tumorweefsel.
3. Specimen Isolatie en Transport
- Isoleer tumorspecimens door chirurgische resectie.
- Onmiddellijk plaatsen tumor specimens in het ijskoude HBSS + / + zo snel mogelijk na verwijdering uit de patiënt. Zodra alle tissue monsters worden verzameld, transport monsters (op ijs) van de werkzame theater voor laboratorium voor verdere verwerking.
4. Tissue Dissociatie en Trituratie
- Volgende standaard steriele techniek in een laminaire stroming kap, brengen conische buis met tumor specimen in de cultuur kap, en was monsters door het buisje en tumor 50x. Laat fragmenten te vallen op de bodem van de buis, en verwijder vervolgens HBSS + / +. Vullen met 30 ml HBSS + / +, en schud / omkeren 50x opnieuw. Herhaal inversie / media verwijdering voor een totaal van 4x.
- Re-schorten tumorfragmenten in 30 ml HBSS + / + voor de laatste keer, en giet het mengsel in een sterile100 mm petrischaal, en aparte tumor in 0,5 cm 3 groeperingen. Als grotere tumorfragmenten worden aangetroffen, gebruiken het weefsel schaar of scalpel (# 11 of # 15 blad) te snijden in kleinere stukken.
- Gebruik de tang om de 0,5 cm 3 weefsel groepen te plaatsen in de individuele HBSS + / + gevuld, 2 ml ronde bodem conischal buizen, allen op het ijs. Gebruik het weefsel schaar om tumorfragmenten blad voor de mond in sub-1 mm fragmenten-de suspensie moet een 'snowglobe' uiterlijk (figuur 1) hebben. Hak de tumor slechts tot de meeste fragmenten sub-1 mm; niet 'over-gehakt' de tumor samples. Plaats volledig gehakt weefsel buis terug op ijs, en herhaal met alle bijkomende specimenbuizen.
- Breng alle gefragmenteerde tumorsteekproeven in een 15 ml conische buis. Een P1000 pipet met een cut / gewijzigd steriele tip werkt goed voor deze stap. Gebruik extra HBSS + / + te spoelen / spoel de 2 ml dissociatie buisjes om ervoor te zorgen dat alle tumor monster is verzameld in 15 ml tube. Spin down mengsel in centrifuge bij 23 ° C, bij 73 xg gedurende 5 minuten.
- Zuigen uit HBSS + / +, het verlaten van de cel pellet. Re-schorten fragmenten in 1:1 mengsel van 0,25% trypsine: 0,2% collagenase (opgelost in HBSS-/ -) - voeg net genoeg om tumorfragmenten in te houden strak suspension. Vervang schroef-top, en plaats in 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. Schud celmengsel ten minste een keer tijdens de incubatie om fragmenten in suspensie te houden. Plaats de Schwannoom cultuur media in de incubator te warm op dit moment ook.
- Na incubatie worden 100 ul FBS aan elke buis om de trypsine te inactiveren en centrifugeer monster bij 23 ° C, 73 g gedurende 5 minuten. Met behulp van een pipet voorzichtig zuigen uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring cel pellet. Voeg het verwarmde kweekmedium (N2/insulin/5% FBS) aan de tumor fragmenten tot een uiteindelijke verhouding van 01:02 tumorfragmenten: kweekmedium (bijvoorbeeld als er 1 ml van tumorfragmenten, voeg in 2 ml verwarmd media).
- Bereid je voor op tumor fijnwrijving door het snijden van de tip van een P1000 pipet tip om een diameter van ongeveer 1-2 mm. Langzaam vermaal de celsuspensie met behulp van steeds kleinere en kleinere pipet diameter tips, totdat je de oplossing eenvoudig kan pipet via een unaltEred P1000 pipet tip. Onmiddellijk verhuizen naar een kleinere tip als je eenmaal de tumor oplossing eenvoudig kan pipet door de tip - niet meer dan vermaal het monster. Indien een groter stuk weefsel blokken aspiratie tijdens tritureren, de pipetpunt tikken op de bodem van de conische buis kan vaak vervolg trituratie.
5. Cell Plating
- Een 0,5 mm 3 fragment van weefsel hebben een 1 x 100 mm schaal, of 4 x 8-well/4-well glijbanen zaad. Net voor het toevoegen van de media / celmengsel, verwijder de laminine oplossing uit de cultuur platen maar laat de platen droog.
- Voor elke 100 mm schaal, los de tumor fragment in 10 ml warm voedingsbodems.
- Voor elk putje van een 4-goed glijbaan, gebruik 750 ul opgewarmd voedingsbodems (3 ml voor de hele dia).
- Voor elk putje van een 8-well slide Gebruik 400 ul verwarmd kweekmedium (3,2 ml van het objectglaasje).
- Incubeer de culturen 37 &# 160, ° C, 100% vochtigheid, 6% CO2. Laat de culturen alleen voor ten minste 36 uur, en wijzig de media als de oplossing is vergeeld (zuur). Anders bij 72 uur veranderen de media, vervolgens om de 2-3 dagen of wanneer de media geworden zuur. Als het materiaal wordt zuur dagelijks meerdere dagen achter elkaar, dit in het algemeen een indicatie van mogelijke bacteriële of gist besmetting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Correcte tumor fragmentatie is essentieel voor optimale zaaien en uitgroei in weefselkweekplaten (figuur 1). Identificatie van schwannoma cellen tijdens de eerste dagen na plateren vaak moeilijk vanwege verduisterende hoeveelheden cellulair puin en rode bloedcellen. Door de 4 e of 5 e dag, zal cel extensies buurt aanhangend tumorfragmenten herkenbaar maken 'rijgen' patronen onder het puin. Latere media veranderingen in het algemeen verwijderen van de meerderheid van de niet-hechtende cellen van de tweede week. Met deze methode kan 90% confluentie worden verwacht tussen 7-14 dagen, afhankelijk van de oorspronkelijke vitaliteit van de tumor fragment vóór hakken en plating dichtheid (Figuur 2). Zoals eerder beschreven, schwannoma culturen lijken naar buiten groeien van kleine fragmenten hechtende tumorfragmenten 9,10. Dergelijke uitgroei is detecteerbaar met het einde van de eerste week. Figuur 2 toont brechtsveld beeldvorming van schwannoma cel uitgroei van een enkele tumor fragment, geschetst in het rood in de rechter benedenhoek. Figuur 3 illustreert de 'bridging' uitgroei die optreedt tussen twee verschillende tumorfragmenten, in kweekputjes immunostained met polyklonaal konijn anti-S100 antilichaam. We routinematig immunostain kweken met anti-S100 of anti-p75 NTR antilichamen tegen dat de kweek verifiëren en positief identificeren schwannoom cellen voor analyse (Figuur 4). Met deze werkwijzen over> 95% van de cellen in deze kweken vertegenwoordigen schwannoma cellen. Schwannoma cellen ook label met gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en ErbB2 onder andere markers 11.
Figuur 1. Vergelijking van dezelfde tumor monster zowel vóór (A) en achterER (B) hakken. Sample bereid in 1,5 ml HBSS + / + met Fenolrood in 2,0 ml ronde bodem conische buis.
Figuur 2. Typisch uiterlijk van culturen op helderveld microscopie. Spindled schwannoma cel uitgroei straalt van tumor fragment, foto genomen op cultuur dag 10. Schaal bar = 100 micrometer.
Figuur 3. Immunokleuring van primaire vestibulaire schwannoma culturen met anti-S100 antilichamen aantonen typische cultuur en celmorfologieën. A) Low power aanzicht uitgroei van vergulde tumorfragmenten, cultuur dag 14. Schaal bar = 200 micrometer B.) Higher power uitzicht op schwannoma cellen met spindled morfologie, cultuur dag 14. Schaal bar = 100 micrometer.
Figuur 4. Immunokleuring van primaire vestibulaire schwannoma culturen cultuur zuiverheid en cel identiteit te bevestigen. A) Culturen immunogekleurd met anti-S100 antilichamen. Kernen zijn gelabeld met DAPI. Schaal bar = 100 micrometer B.) Culturen immunostained met anti-p75 NTR antilichamen. Kernen zijn gelabeld met DAPI. Schaal bar = 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geschiedenis van de in vitro Schwannoom Cultures
Inspanningen om vast te stellen in vitro schwannoma culturen begon enkele decennia na de eerste akoestische neuroma open chirurgische resectie plaatsvond in 1894 12. De eerste geregistreerde culturen waren door Kredel in de jaren 1920, die tevergeefs probeerde om gehakt tumor groeien door "opknoping druppel methode" 12 . Later, Drs. Murray en Stout publiceerden hun in vitro kweek ervaring met neurilemomas geteeld op clotted menselijk plasma. Interessant is dat deze techniek bleek dat Antoni A en Antoni B specifieke fragmenten groeide anders, met unieke cellulaire morfologie en gedifferentieerde agar liquefactie 13. Cravioto en Lockwood gepubliceerd verdere waarnemingen van akoestische neuroma culturen in aviaire stolsels op coverglass slips en roller buizen. Zij waren ook de eerste die Rose kamers gebruiken voor time-lapse imaging van tumorgroei
Voordelen van Vestibulaire Schwannoom Primaire culturen
Studies van menselijke schwannoma tumorigenesis gebruiken vaak homogene onsterfelijk gemaakte cellijnen en transgene muismodellen. Dergelijke hulpmiddelen zijn gunstig, maar do niet exact de genotypes, fenotypes, en de complexiteit van menselijke ziekte. Daarentegen primaire culturen waarschijnlijk zorgen voor een meer realistisch model. Ze getrouwer recapituleren de heterogeniteit van genomics en moleculaire status die bij menselijke tumoren 15.
Zuiverheid van Schwannoom Culturen
Een uitdaging van primaire weefselkweek handhaaft doelcel zuiverheid. Schwannomen overwegend bestaan uit neoplastische Schwann-cellen 6, maar culturen zijn niet immuun voor fibroblast besmetting. Historisch gezien, methoden voor het optimaliseren schwannoma cel zuiverheid vallen in drie categorieën: 1) selectie door chemisch welbepaald medium en specifieke groeifactoren; 2) immunozuivering (bijvoorbeeld met magnetische kralen celsortering 7), 3) een combinatie van beide voorgaande werkwijzen. In minder dan 5% van de cellen onze ervaring fibroblasten of andere niet-schwannoom cellen omvatten in het algemeen in de culture, ongeacht de kenmerken van de patiënt (leeftijd, geslacht), sporadische of NF2-geassocieerde tumoren, primaire of secundaire tumor resectie, of cystic vs solide tumor types. Als fibroblasten verschijnen over de cultuur te nemen, zal het verwijderen van het serum voor 1-2 media significant verandert deze populatie te verminderen zonder afbreuk te doen schwannoma overleving van de cel. Voorbehandeling van celkweek oppervlakken met laminin vergemakkelijkt ook de groei schwannoma cel 9. Minimale passage van de culturen helpt ook om ongewenste cellulaire verontreiniging verminderen - cryo het best binnen de eerste twee passages cultuur en de cultuur experimenten wordt niet aanbevolen na passage 4-5. Vinden we een optimaal resultaat wanneer cultuur experimenten wordt ingevuld door passage 1-2 met niet-cryostored cellen.
Wij gebruiken zowel immunostaining (anti-S100, DAPI) en microscopische verschijning van cellulaire en nucleaire morfologie als kwaliteitscontrole in onze schwannoma culturen. Af en toeis het nuttig om een subset van culturen voor monocyten (CD68) of fibroblast specifieke markers immunostain tot cultuur zuiverheid 9 verder te verifiëren. Bij experimenteel onderzoek celgedrag (bijv. proliferatie of celdood), we altijd immunostain met anti-S100 of anti-p75 NTR antilichamen te verifiëren dat de bevindingen schwannoma celspecifieke.
Cultuur morfologie en groeipatronen
Schwannoma tumor culturen typisch weer uniek groeipatronen denken aan Antoni A (hoge celdichtheid, strak georganiseerd, indicaties van Verocay lichaam formaties) en zelden van Antoni B (relatief schaars kernen, overvloedige cellulaire processen, minder organisatie) patronen gezien in histopathologie van gereseceerde schwannoma tumoren 16. Bijna alle schwannoma cellen vertonen de klassieke lange, spindled, bipolaire cel vorm geassocieerd met zowel Schwann en schwannoma cellen 6,17 echter andere mobiele morphologies, zoals beschreven door Cravioto (Amoeboid microglia-achtige cellen, spoelvormige cellen,-Racket vormige cellen, en Kite-vormige cellen) komen soms voor 14. Overall, celgroei en proliferatie zijn erg traag in onze basis medium (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 supplement). Toevoeging van bekende mitogene factoren zoals forskoline en β1-neureguline verhoogt celproliferatie 18.
Kritische Protocol Stappen
Onze schwannoma weefselkweek protocol is eenvoudig en redelijk vergevingsgezind; maar er zijn een aantal belangrijke stappen die succes garanderen. Eerste, juist tumor behandeling is van cruciaal belang. Verwacht het beste resultaat bij tumor direct in ijskoud HBSS + / + is geplaatst zo snel mogelijk nadat het is verwijderd uit de patiënt. Dit in tegenstelling tot de gebruikelijke chirurgische praktijk van het verzamelen uitgesneden tumor in steriele zoutoplossing dan het versturen van de totale weefsel voor verwerking in de pathologie aan het einde van de zaak. Ten tweede houden weefsel samples zo koel mogelijk tijdens de verwerking. Het is essentieel dat de weggesneden tumor gehouden ijskoud, en dat de bewerking zo doelmatig mogelijk na verwijdering. Doe zo veel van het weefsel verwerking mogelijk op ijs ook. Ten derde, agressief was de tumor samples. Hierdoor neemt het risico van bacteriële of gist verontreiniging te verminderen. Ten vierde, niet over-gehakt tumorspecimens. Tumor trituratie afhankelijk van een semi-subjectieve beoordeling van wanneer verder met een kleinere diameter P1000 pipetpunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Ondersteuning: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
