Summary
Vestibüler Schwannomalar (VSS) TNF2 tümör baskılayıcı gen mutasyonu ile ilişkili Schwann hücre (SC) kökenli olmayan habis tümörler vardır. Biz, moleküler ve hücresel deneysel manipülasyon ve analiz için izin verir ve insan hastalığının heterojen doğası tekrarıdır hücre kültürü VS birincil insan için yeniden üretilebilir ve etkili protokolü sunulmaktadır.
Abstract
Vestibüler schwannomalar (VSS) tüm intrakraniyal tümörlerin% 10 taviz, Schwann hücresi vestibüler sinirin (SC) tümörler temsil eder. Vss hem TNF2 tümör baskılayıcı olarak inaktive kusurları ile ilişkili sporadik veya ailesel ya (Nörofibromatozis tip 2, NF2) formlar, meydana Gen. VSS tedavisi ancak bu tür prosedürlerin morbidite daha az invaziv tedaviler soruşturmaları tahrik olan, genellikle cerrahi rezeksiyon veya radyocerrahi olduğunu. Tarihsel olarak, taze doku örneklerinin erişim ve schwannoma hücreler immortalize değildir gerçeğinin olmaması önemli schwannoma Tümörgenez araştırılması için primer kültürlerinde kullanımını engellemiştir. Primer kültürlerin sınırlı kaynağı üstesinden gelmek için, ölümsüz kılınmış hücre kuşağı HEI193 VS HPV E6 ve E7 onkogenler ile transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu onkojenik transdüksiyon insan s için bir model olarak, kullanımlarını sınırlayan hücrelere, önemli moleküler ve fenotipik değişiklikler ortayachwannoma tümörler. Bu nedenle hücreler VS primer insan kültürü için basitleştirilmiş, tekrarlanabilir bir protokol göstermektedir. Bu kolayca hakim teknik daha doğru VS hastalığın karmaşıklığı özetlemek moleküler ve hücresel incelemeler için izin verir.
Introduction
Vestibüler schwannomalar (VSS) tüm intrakraniyal tümörlerin 1-3 10% ödün, Schwann hücresi vestibüler sinirin (SC) tümörler temsil eder. Vss hem TNF2 tümör baskılayıcı olarak inaktive kusurları ile ilişkili sporadik veya ailesel ya (Nörofibromatozis tip 2, NF2) formlar, meydana Gen. VSS tedavisi ancak bu tür prosedürlerin morbidite sağırlık, yüz nöropatlien omurilik sıvısı kaçağı, dengesizlik, ve tümör büyütme 1 içerir, genellikle cerrahi rezeksiyon veya radyocerrahi olduğunu. Buna ek olarak her hasta olarak kabul edilebilir bir cerrahi veya radyasyon adaylardır. Alternatif tedaviler gibi önemli morbidite yanı sıra bir eksikliği yeni tedaviler 3,4, gelişmekte umuduyla VSS eşsiz moleküler biyoloji soruşturma tahrik vardır.
Hücre kültürü potansiyel tedavi com moleküler ve hücresel davranış ve tarama, hızlı kolay ve derinlemesine analiz sağlarlira. Tarihsel olarak, taze doku örneklerinin erişim ve schwannoma hücreler immortalize değildir gerçeğinin olmaması önemli schwannoma Tümörgenez araştırılması için primer kültürlerinde kullanımını engellemiştir. Primer kültürlerin sınırlı kaynağı üstesinden gelmek için, ölümsüz kılınmış hücre kuşağı HEI193 VS HPV E6 ve E7 onkogenler 5 ile transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu onkojenik transdüksiyon schwannoma, insan tümörleri için bir model olarak, kullanımlarını sınırlayan hücrelere, önemli moleküler ve fenotipik değişiklikler getirmiştir. Fonksiyonel NF2 geni eksik transgenik fare hatları türetilen SC in vitro kültürler NF2 bağımlı SC tümörogenez araştırmak için başka bir alternatif oluşturmaktadır. Bu kültürler, ancak insan belirli bir davranış insan VSS veya hesabın heterojen doğasını özetlemek için başarısız. Çoğu önceki VS kültür teknikleri nispeten uzun işlem süreleri ve karmaşık seçici kültür teknikleri 6-8 gereklidir.Immun boyama ile saptandığı haliyle Burada% 95 tümör hücresi saflıkta altında, 3 saat içinde tam bir işlem ile hücre kültürü VS primer için basit ve tekrarlanabilir bir protokol, mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Açıklama: Bu protokolde insan tümör örneklerinin kullanılması Iowa Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi (KİK) tarafından onaylanmıştır.
1.. Kur Gün önce Tümör Hasat
- Coat Hücre Kültürü Plakaları: bir steril kültür başlık olarak, kapak yerine, bir polistiren / plastik kültür kuyu / çanak alt karşılamak için yeterli poli-L-ornitin (% 0.01 solüsyon) ekleyin ve en azından oda sıcaklığında bekletin 2 hr. Cam slaytlar, lameller veya görüntüleme gerektiren deneyler için polistiren için ikame edilebilir.
- 2 saat sonra, emme ile poli-L-ornitin çözeltisi çıkarın ve plakaları bir steril kültür davlumbaz tamamen kurumaya bırakın. Kadar laminin solüsyonu (Ca 2 10 ug / ml + / Mg2 + içermeyen HBSS [HBSS-/ -]) tamamen kültür plakaları kaplamak için, kapak yerine, daha sonra gece boyunca 4 ° C soğuk buzdolabı içinde 1) yeri, ya ya da 2), en az 2 saat boyunca 37 ° C inkübatör yerleştirin. Eğer plakalargecede veya daha uzun saklanır, buharlaşma / kuruma önlemek için plastik wrap plakaları sarın.
2.. Kurulum Tümör Hasat Günü
- Hazırlama Kültür Ortamı: Ortam, tümör hasat ve işleme gününde taze yapılmış 4 ° C'de saklanır ve hemen önce ortam ilave ve / değişir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ısıtılır.
- Schwannom kültür ortamı 0,1 mg / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin ile yüksek glikoz (4.5 mg / ml) (fenol kırmızısı ile) DMEM olduğu; N2 ortamı son seyreltme 1:100 takviyesi; Bovine İnsülin 5 ug / ml; % 10 toplam hacme Fetal Sığır Serumu. 0.22 mikron filtre ile tüm medya filtre.
- Örnek Transport Soğutucu hazırlayın: ameliyathaneye 2 + (HBSS + / +) 2 + Ca / Mg ile birlikte 25 ml HBSS ile steril 50 ml konik tüp (hasat edilmesi, tümörün miktarına bağlı olarak) 1-2, bir buz dolu bir soğutucu gönder tümör numune transferi ve ulaşım için.
- Indiv hazırlayınidual tümör ayrışma tüpleri - 1 HBSS'nin + / + ml ve buz üzerinde yer ile yuvarlak steril 2 ml alt tüpler doldurun. (Tüpler tümör örneklerinin keskin diseksiyon / ayrışması için kullanılan edilecektir).
- Ayrışma için, hasat edilen doku, her 0.5 cm 3 için yaklaşık bir ayrılma tüpü hazırlanması; örneğin, 1.0 x 1.0 x 1.0 cm (1 cm3) ölçen bir tümör numunesi iki HBSS + / + ayrılma tüpler gerektirecektir.
- Ultraviyole ışık sterilizasyon: Yer doku makas, küçük forseps, neşter sapı, 1x normal bir Petri kabı, P1000 pipet ve steril bir kültürü kaputu pipet uçları, ve ~ için ultraviyole ışık altında bırakmak öncesinde tümör dokusunun geliş ve işleme 15 dk.
3.. Numune İzolasyon ve Ulaşım
- Cerrahi rezeksiyon ile tümör örnekleri izole.
- Hemen hastadan çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, buzla soğutulmuş HBSS + / + içine tümör örnekleri yerleştirin. Bir kez tüm tissue örnekleri daha fazla işlem için laboratuara ameliyat tiyatro, (buz üzerinde) taşıma örnekleri toplanır.
4.. Doku Ayrılma ve triturasyon
- Laminer akış kaputu standart, steril tekniği izleyerek, kültürü kaputu içine tümör örneği ile konik tüp getirmek ve tüp ve tümör 50x evirerek örnekleri yıkayın. Fragmanları, tüpün altına düşer ve daha sonra HBSS + / + çıkarmak için izin verin. 30 ml HBSS + / + ile doldurun ve ajitasyon / tekrar 50x ters. 4x toplam inversiyon / medya kaldırma tekrarlayın.
- 30 ml HBSS + / + son kez, sonra bir sterile100 mm petri içine karışımı dökün, ve ayrı tümör 0,5 cm içine 3 gruplar içinde tümör fragmanları askıya yeniden. Büyük tümör fragmanları karşılaşılan, küçük parçalar halinde kesmek için makas veya neşter doku (# 11 veya # 15 bıçak) kullanın.
- Bireysel HBSS + / + dolu içine 0.5 cm 3 doku grupları yerleştirmek için forseps kullanın, 2 ml'lik yuvarlak dipli konikTüm buz üzerinde arkadaşları borular. A 'snowglobe' görünümü (Şekil 1) sahip olmalıdır alt 1 mm fragmanları-süspansiyona tümör parçaları kıyma doku makas kullanın. Parçalarının çoğunluğu alt 1 mm kadar sadece tümör kıyma; değil 'over-kıyma' tümör örnekleri yapın. Geri buz tamamen kıyılmış doku tüpü yerleştirin ve tüm ek numune tüpleri ile tekrarlayın.
- Tek bir 15 ml konik tüp içine tüm parçalanmış tümör örnekleri aktarın. Bir kesim / modifiye steril ucu ile bir P1000 pipet, bu adım için iyi çalışır. Kullanın ekstra HBSS + / + emin tüm tümör numune 15 ml tüp içinde tahsil edilmiştir yapmak için 2 ml ayrışma tüpler durulama / temizlemek için. 5 dakika boyunca 73 x g, 23 ° C 'de santrifüj içinde bir karışımı aşağıya doğru dönerler.
- Hücre topaklarını bırakarak HBSS + / + kapalı emme. % 0.25 tripsin 1:1 karışımı içinde fragmanları yeniden askıya (HBSS-/ içinde çözülmüş -) -% 0.2 'lik kolajenaz tümör parçalarını tutmak için yeterince sıkı eklemek SUspension. 30 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde vidalı üst ve bir yer değiştirme. Süspansiyon parçaları korumak için inkübasyon sırasında en az bir kez hücre karışımı çalkalayın. De bu anda ısınmak için kuvöz içine Schwannom kültür ortamı yerleştirin.
- İnkübasyondan sonra, 23 ° C, 5 dakika için 73 x g tripsin etkisiz hale getirmek için her bir tüpe 100 ul FBS ekleme ve daha sonra santrifüj örnek. Bir pipet kullanarak, dikkatli bir hücre pelet bozmadan mümkün olduğunca süpernatant aspire. 01:02 tümör parçalarının nihai oranı tümör fragmanları için ısıtıldı kültür ortamı (N2/insulin/5% FBS) ekleyin kültür ortamı (örneğin tümör parçalarının 1 mi var ise, ısıtılmış ve 2 ml ekle medya).
- Yaklaşık 1-2 mm'lik bir çapa bir P1000 pipet ucu kapalı ucu kesilerek tümör toz haline getirme için hazırlayın. Kolayca bir unalt yoluyla çözüm pipetle kadar yavaş yavaş, giderek daha küçük ve daha küçük çaplı pipet ipuçlarını kullanarak hücre süspansiyonu çiğnemekniyor P1000 pipet. Kolayca ucundan tümör çözüm pipetle bir kez hemen küçük bir ucuna hareket - over örnek çiğnemek yok. Konik tüpün alt pipet çekme toz haline getirme sırasında doku blokları aspirasyon daha büyük tek bir parça, genellikle sürekli ince toz haline koyma izin veriyorsa.
5.. Hücre Kaplama
- Doku biri 0.5 mm 3 parçası 1 x 100 mm tabak veya 4 x 8-well/4-well slaytlar tohum için yeterlidir. Hemen önce medya / hücre karışımı ekleyerek, kültür plakaları laminin çözüm kaldırmak ancak plakaları kuru izin vermeyin.
- Her 100 mm tabak için 10 mi ısıtıldı kültür ortamı olarak tümör parçası çözülür.
- 4-iyi bir slayt her bir kuyu için 750 ul ısıttı kültür ortamı (tüm slayt için 3 ml) kullanın.
- 8-iyi slayt her bir kuyu için 400 ul ısıttı kültür ortamı (tüm slayt için 3.2 ml) kullanın.
- 37 ve en kültürleri inkübe# 160; ° C,% 100 nem,% 6 CO2. En az 36 saat süre ile, tek başına kültürleri bırakın ve daha sonra solüsyon (asidik) sararmış ise ortamı değiştirmek. Aksi takdirde daha sonra her 2-3 gün veya ortam asidik olunca, 72. saatte ortamı değiştirmek. Ortam üst üste birkaç gün boyunca günlük olarak asidik hale gelmesi durumunda, bu genellikle potansiyel bakteri ya da maya kontaminasyon bir göstergesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğru tümör parçalanması doku kültür tabaklarında uygun tohumlama ve oluşumun (Şekil 1) için gereklidir. Kaplama sonraki ilk günlerinde schwannoma hücrelerin tanımlanması nedeniyle hücre döküntüleri ve kırmızı kan hücrelerinin miktarda örtücü için, çoğu zaman zordur. 4 veya 5 inci inci gün, yapışık tümör parçalarının yakınında hücresi uzantıları enkaz arasında desenleri 'bağlama' tanınabilir yaratacaktır. Daha sonraki ortam değişikliği genel olarak, ikinci hafta yapışmayan hücrelerin çoğunluğu kaldırmak. Bu yöntem kullanılarak,% 90 izdiham 7-14 gün arasında beklenebilir önce (Şekil 2) kıyma ve yoğunluğu kaplama için tümör fragmanının ilk canlılık bağlı olarak değişir. Daha önce açıklandığı gibi, schwannoma yapışkan kültürler tümör parçaları 9,10 küçük parçalarının dışarı doğru büyümeye görünür. Bu tür akıbet ilk hafta sonunda algılanabilir. Şekil 2 b Şekilsağ alt köşesinde kırmızı özetlenen tek bir tümör parçası, gelen Schwannom hücre büyümesinin rightfield görüntüleme. 3. iki farklı tümör parçaları arasında gerçekleşir 'köprü' akıbet göstermektedir Şekil, kültür kuyularda poliklonal tavşan anti-S100 ile immunosteyn. Rutin kültürlerin saflığını teyit ve pozitif (Şekil 4) analizi için schwannoma hücreleri belirlemek için, anti-S100 ya da anti-p75 antikorları ile NTR kültürleri immunostain. Bu yöntemler ile bu kültürlerde hücre 95> üzerinde% schwannoma hücreleri temsil eder. Schwannom hücreler de diğer belirteçler 11 arasında glial fibriller asidik protein (GFAP) ve ErbB2, etiketleyin.
Şekil 1. (A) önce ve arka her ikisi de aynı tümör numunesinin karşılaştırmasıer (B) kıyma. örnek 1.5 ml 2.0 ml Fenol Kırmızısı ile HBSS + / + yuvarlak dipli konik tüp hazırlanır.
Şekil 2.. Aydınlık mikroskobu kültürlerin tipik görünümü. Spindled Schwannoması hücre akıbet tümör fragmanı yayar, kültür 10. gününde çekilen görüntü. Ölçek çubuğu = 100 mikron.
Anti-S100 antikorlar tipik kültürü ve hücre morfolojileri gösteren primer vestibüler schwannoma kültürlerin Şekil 3.. İmmünoboyama. Kaplama tümör parçaları, kültür 14. gün. Ölçek çubuğu = 200 mikron. B'den A) Düşük güç görünümü gösteren akıbet) Yükseköğretim powiğsi morfoloji, kültür 14. gün. Ölçek çubuğu = 100 mikron ile schwannom hücrelerin er görünümü.
Kültür saflığını ve hücre kimliğini onaylamak için birincil vestibüler Schwannoması kültürlerin 4. Immünoboyamasıdır rakam. A) Kültürler anti-S100 antikorları ile immüno-lekelendi. Çekirdekler DAPI ile etiketlenmiş. Anti-p75 NTR antikorlar ile boyanmış Ölçek çubuğu = 100 mikron. B) Kültürler. Çekirdekler DAPI ile etiketlenmiş. = 100 mikron ölçekli bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro Schwannom Kültürleri Tarihi
Vitro schwanom kültürlerde kurmak için çabalar açık cerrahi rezeksiyon 1894 12 yılında meydana gelen ilk akustik nöroma sonra sadece bir kaç yıl başladı. İlk kaydedilen kültürleri başarısız "asılı damla yöntemiyle" 12 ile kıyılmış tümör büyümeye çalışmış 1920'lerde Kredel tarafından vardı . Daha sonra, Dr. Murray ve Stout pıhtılaşmış insan plazma yetiştirilen neurilemomas ile in vitro kültür deneyimini yayınladı. İlginçtir, bu teknik Antoni A ve Antoni B özgü fragmanlar ağar sıvılaşma 13 benzersiz hücresel morfoloji ve diferansiyel oranları ile, farklı büyüdüğünü ortaya koydu. Cravioto ve Lockwood coverglass fişleri ve silindir tüpleri üzerinde kuş pıhtıları akustik nöroma kültürlerin daha gözlemleri yayınladı. Bunlar aynı zamanda tümör büyüme time-lapse görüntüleme için Gül odaları kullanmak ilk idi
Vestibüler Schwannom İlköğretim Kültürlerin Faydaları
İnsan schwannoma Tümörgenez çalışmalar, genellikle homojen bir ölümsüz hücre çizgileri ve transjenik fare modelini kullanmaya. Bu tür araçlar yararlı ama d vardıro doğru genotipleri, fenotipleri ve insan hastalığının karmaşıklığını yansıtmaz. Buna göre, birincil kültürleri muhtemelen daha gerçekçi bir model sağlar. Bunlar daha sadakatle insan tümörlerinin 15 ile ilişkili genomik ve moleküler durumu heterojenliğini recapitulate.
Schwannom Kültürlerin Saflık
Primer doku kültürü bir meydan okuma hedef hücre saflığını muhafaza edilir. Schwannomalar ezici neoplastik Schwann hücrelerinin 6 oluşur, ancak kültürler fibroblast kirlenmeye karşı bağışık değildir. Tarihsel olarak, üç kategoride Schwannoması hücre saflık düşüş optimize yöntemleri: kimyasal olarak tanımlanmış orta ve spesifik büyüme faktörleri tarafından 1) seçimi; Manyetik tane hücre 7, sıralama 2) immünolojik (örneğin), 3) Yukarıdaki yöntemlerin her ikisinin bir kombinasyonu olabilir. Bizim deneyim fibroblastlar veya diğer non-Schwannoması hücreler genellikle kültürlerdeki hücrelerin daha az olduğu% 5'i olarakne olursa olsun hasta özellikleri (yaş, cinsiyet), sporadik veya TNF2 ilişkili tümörler, primer veya sekonder tümör rezeksiyon veya solid tümör tipleri vs kistik arasında yeniden. Fibroblastlar kültür devralarak gibi görünüyorsa, 1-2 ortam değişiklikleri için serum kaldırılması önemli olumsuz Schwannoması hücre yaşamını etkilemeden bu nüfusu azaltacaktır. Laminin ile hücre kültürü yüzeyleri ön muamele, aynı zamanda, hücre büyümesi schwannoma 9 kolaylaştırır. Dondurulup en iyi ilk iki kültür pasajların içinde tamamlanır ve kültür deneme geçişi 4-5 ötesinde tavsiye edilmez - kültürlerin Minimal pasajı da istenmeyen hücresel kirlenmeyi azaltmak için yardımcı olur. Kültür deneme olmayan cryostored hücreleri ile geçişi 1-2 tamamlandığında Biz optimum sonuçlar bulabilirsiniz.
Biz immun boyama (anti-S100, DAPI) ve bizim Schwannoması kültürlerde kalite kontrol önlemleri gibi hücresel ve nükleer morfolojisinin mikroskobik görünüm hem kullanabilirsiniz. Bazen buayrıca kültür saflığını 9 doğrulamak için monosit (CD68) veya fibroblast spesifik belirteçler için kültürlerin bir alt kümesini immunostain yardımcı olur. Hücre davranış (örneğin, çoğalması ya da hücre ölümü) deneysel analizler sırasında, her zaman bulguları spesifik Schwannoması hücre olduğunu doğrulamak için, anti-S100 veya anti-p75 NTR antikorlar immunostain.
Kültür morfolojisi ve büyüme modelleri
Schwannom tümör kültürler genellikle benzersiz büyüme modelleri (yüksek hücre yoğunluğu sıkı örgütlü, Verocay vücut oluşumları endikasyonları) Antoni A anımsatan ve nadiren Antoni B (nispeten seyrek çekirdekler, bol hücresel süreçleri, daha az organizasyon) rezeke schwannomun histopatolojik görülen desenler gösterilecek 16 tümörleri. Neredeyse tüm schwanom hücreler Schwann ve Schwannoması hücrelerin 6,17 ancak diğer hücre morfolojik hem de ilişkili klasik uzun, iğsi, bipolar hücre şekli gösterilecekLogies, Cravioto (amoeboid Mikroglia gibi Hücreler, iğ şekilli hücreler, Raket-Şekilli Hücreleri ve Kite-Şekilli Hücreleri) tarafından tarif edildiği gibi bazen 14 oluşabilir. Genel olarak, hücre büyümesi ve çoğalması bizim baz ortamı (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 ek) çok yavaştır. Örneğin forskolin ve β1-neuregulin gibi bilinen mitojenik faktör eklenmesi önemli ölçüde hücre çoğalmasını 18 artar.
Kritik Protokol Adımlar
Bizim schwanom doku kültürü protokol basit ve oldukça bağışlayıcı; Ancak başarı sağlamak birkaç önemli adım vardır. Birincisi, doğru tümör işleme önemlidir. Tümör kısa sürede bir kez hastadan çıkarılır mümkün olduğu, buzla soğutulmuş HBSS + / + doğrudan yerleştirildiği zaman en iyi sonuçları bekliyoruz. Bu, steril tuzlu su daha sonra durum sonunda patolojisinde işlem için toplam doku gönderilmesinde resekte tümörün toplama olağan cerrahi uygulamaya terstir. İkincisi, doku samp tutmakişlem sırasında mümkün olduğunca serin les. Bu Kesilen tümör buz soğuk tutulması çok önemlidir ve bu işleme çıkarılmasını takiben mümkün olduğunca amaca oluşur. De buz üzerinde mümkün olduğu doku işleme kadar yapın. Üçüncü olarak, agresif tümör örnekleri yıkayın. Bu bakteri veya maya kirlenme riskini azaltmaya yardımcı olur. Dördüncü, aşırı kıyma tümör örnekleri yok. Tümör tritürasyon daha küçük çaplı bir P1000 pipet ucu ile devam zaman bir yarı öznel değerlendirmesine bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ifşa etmek.
Acknowledgments
Destek: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
