Vi beskriver her en protokol for oprensning og karakterisering af plante protein komplekser. Vi viser, at ved immunopræcipitere et enkelt protein i et kompleks, så vi kan identificere sine post-translationelle modifikationer og dets interagerende partnere.
Planter hurtigt at tilpasse sig skiftende miljøer på grund uddybe opfattelsen og signalsystemer. Under patogen angreb, planter reagere hurtigt på infektion via rekruttering og aktivering af immunkomplekser. Aktivering af immunkomplekser er forbundet med post-translationelle modifikationer (PTMS) af proteiner, såsom phosphorylering, glycosylering eller ubiquitinering. Forstå, hvordan disse PTMS er koreograferet vil føre til en bedre forståelse af, hvordan modstand er opnået.
Her beskriver vi en proteinoprensning fremgangsmåde til nukleotid-bindende leucinrig gentagelse (NB-LRR)-interagerende proteiner, og den efterfølgende identifikation af deres post-translationelle modifikationer (PTMS). Med små ændringer kan protokollen anvendes til rensning af andre plante protein komplekser. Metoden er baseret på ekspressionen af en epitop-mærket version af proteinet af interesse, som derefter delvist oprenset by immunpræcipitation og underkastes massespektrometri til identifikation af interagerende proteiner og PTMS.
Denne protokol viser, at: i). Dynamiske ændringer i PTMS såsom phosphorylering kan detekteres ved massespektrometri ii). Det er vigtigt at have tilstrækkelige mængder af proteinet af interesse, og det kan kompensere for manglen af renheden af immunopræcipitatet iii). For at påvise PTMS af et protein af interesse, dette protein skal immunpræcipiteret at få en tilstrækkelig mængde af protein.
Immun veje afhængige af forskellige post-translationelle modifikationer (PTMS) af proteiner til hurtigt at transducere signaler og aktivere immunresponser 1. PTMS er hurtige, reversible, og meget specifikke kemiske ændringer af proteinstruktur, der kan påvirke protein-konformation, aktivitet, stabilitet, lokalisering og protein-protein interaktioner 2-4. I planter har mere end 300 typer af PTMS blevet identificeret, herunder ubiquitination sumoylation, sulfatering, glykosylering og phosphorylering 2,5. En voksende mængde af beviser fremhæver betydningen af PTMS i forskellige aspekter af plante immunitet 1,5,6. Proteinphosphorylering, den reversible fastgørelse af en fosfat gruppe til en serin, threonin eller tyrosin rester er en regulator af mange cellulære funktioner og ikke overraskende de mest studerede PTM i plante forsvar signalering kaskader 5-11. Phosphorylering-afhængig signalering er en integreret del af anlægget sikkerhNSE aktivering påbegyndt efter ekstracellulær opfattelse af mikrober ved transmembrane receptorer, eller intracellulær anerkendelse af Multidomain modstand proteiner 5,8.
Efter invaderende planter er mikrober detekteres ved plasmamembran-receptorer kaldet mønstergenkendelsesteknikker receptorer (PRRS) 12. PRRS er enten receptor-lignende proteiner (RLPs) eller receptor-lignende kinaser (RLKs), som begge bærer et ligandbindende ektodomænet og en enkelt-pass transmembrane domæne. I modsætning til RLPs, RLKs har et intracellulært kinase domæne 13-15. Ektodomænet PRRS binder til konserverede mikrobe elicitor molekyler kaldet patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) førende, i tilfælde af RLKs til autophosphorylering og transphosphorylering i det intracellulære domæne 6, 16. Nedstrøms for opfattelsen-induceret phosphorylering af PRRs, efterfølgende phosphorylering af cytoplasmatiske proteiner, herunder kinaser 17, </sup> 18 E3 ligase 19 mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK'er) 20, 21, calcium-afhængige proteinkinaser (CDPK) 22, 23 og transkriptionsfaktorer 24, 25 fører til PAMP-udløste immunitet (PTI).
Ud over det ekstracellulære opfattelse af PRRs er intracellulær anerkendelse af patogener gennem cytoplasmatiske receptorer. Disse multidomain modstand (R)-proteiner indeholder en variabel N-terminale domæne, et centralt nukleotid-bindende (NB) motiv, og C-terminale leucin-rige gentagelser (LRR), og derfor kaldes NB-LRR-proteiner 26, 27. R-proteiner direkte eller indirekte anerkende patogen-afledt virulens molekyler kaldet effektorer, også kendt for at målrette PRRs og andre knudepunkter i immunsystemet. Anerkendelse inducerer stærke forsvar fører til effektor-udløst immunitet (ETI) 28-31. NB-LRR proteiner har en requisite ATP-bindende motiv i NB domæne 30, 32, men de mangler en kinase domæne. Phosphorylering af konserverede domæner af NB-LRRs er blevet rapporteret i en storstilet proteom undersøgelse 33, men dets relevans for ETI er uklar. Ligeledes til PTI, aktivering af NB-LRR proteiner fører til phosphorylering af cytoplasmatiske proteiner, herunder MAPKs 34-37 og CDPKs 38-40. Vigtigst er det, kan effektor anerkendelse føre til phosphorylering af accessoriske proteiner, der interagerer direkte med NB-LRR proteiner 41. Nogle eksempler kan nævnes RIN4 (Arabidopsis thaliana) og PTO (tomat, Solanum lycopersicum) proteiner, der interagerer med NB-LRR proteiner RPM1 42, 43 og Prf 44, hhv. Under infektion med Pseudomonas syringae bakterier effektor-proteinet AvrB inducerer RIN4 phosphorylering, sandsynligvis af receptor-lignende kinase RIPK 45 <sup> 46.. Ligeledes i tomat P. syringae effektorer AvrPto og AvrPtoB fremkalde phosphorylering af Pto 47. I modsætning til RIN4 som mangler en kinasedomæne og skal være trans-phosphoryleret, PTO er en aktiv kinase i stand til auto-phosphorylering 48 og trans-phosphorylering af substrater 49, 50. Mens Pto kræver sin kinase aktivitet for effektor-afhængig initiering af signalering, kinase-døde Pto mutanter er stadig i stand til at signalere i en effektor-uafhængig måde 51. Vi forklarede for nylig disse observationer ved at påvise, at Prf / Pto komplekset er oligomere indeholdende flere Prf og Pto molekyler 52 og at Pto molekyler i samme kompleks, kan trans-phosphorylere hinanden 47. Vi foreslog en model, hvor et molekyle af Pto (sensor) interagerer med effektor-protein, der forårsager en konformationsændring til NB-LRR protein (Prf), som igen aktiverer en anden Pto molekyle (hjælper) within komplekset. Efterfølgende hjælperen Pto molekyle trans-phosphorylerer sensoren Pto fører til fuld aktivering af modstanden kompleks 47.
Disse eksempler viser, at identifikationen af immun komplekse komponenter og deres potentielle PTMS på effektor anerkendelse kan føre til en bedre forståelse af, hvordan signaler transduceres fra effektor opfattelse til downstream mål. Her beskriver vi en proteinoprensning fremgangsmåde til NB-LRR-interagerende proteiner og den efterfølgende identifikation af deres PTMS. Vi bruger Nicotiana benthamiana og tomat Prf / Pto komplekst som en model, men den samme protokol kan nemt anvendes på RLKs fra N. benthamiana og A. thaliana 53 med små ændringer, som vi beskriver i protokollen.
Belyse den mekanisme af receptor-aktivering ved PAMPs og effektorer høj grad kan bidrage til vores forståelse af plante immunitet. I de sidste 20 år har genetiske og gær to-hybrid-skærme været medvirkende til opdagelsen af PRRs og NB-LRR proteiner. Mere for nylig er blevet etableret massespektrometri-baserede protokoller til identifikation af proteiner reguleres differentielt i immun signalering 55-58, deres PTMS 11,33,59,60, sammensætningen af immunkomplekser 61 og effektor målretter 62. Her beskriver vi en enkel protokol til identifikation af PTMS regulerer aktiveringen af immunkomplekser.
I sammenligning med tidligere beskrevne protokoller, denne protokol tillader detaljeret identifikation af dynamiske ændringer i PTMS. Protokoller af store proteomics tilgange kan identificere PTMS af proteiner, men er ikke i stand til at afsløre stedet plasticitet PTMS grund til at begrænseed mængder af protein. I tilfælde af protein-phosphorylering, store proteomics metoder typisk kun identificere de fremherskende phosphoryleringssteder 11,33,59. Den detaljerede karakterisering af et protein phosphorylering status kræver en betydelig mængde af protein, som kan frembringes ved delvis oprensning af målproteinet 47. Protokollen beskrevet her par en proteinoprensning fremgangsmåde, der giver en betydelig mængde af målproteinet med massespektrometri-analyse af det oprensede protein. Efter denne protokol blev den eneste fosforylering tilfælde af Pto tilskrives overvejende Ser-198 som tidligere beskrevet 52, men nogle massespektrometri spektre støttede også en enkelt fosforylering begivenhed på Thr-195 eller Thr-199. Når dobbelt phosphorylerings begivenhederne i Pto blev observeret, den dominerende kombination af fosforylaterede aminosyrer var Ser-198 og Thr-199, selv om kombinationer på andre sites også blev observeret (Tabel 1). Disse resultater viser klart phosphoryleringssted plasticitet proteinkinaser og evnen af den beskrevne protokol til at karakterisere i detaljer alle mulige phosphoryleringssteder.
De mest kritiske trin i denne protokol er: 1) tilstrækkelig udvinding af proteiner, 2) beskyttelse af PTMS og 3) tilstrækkelig mængde af target protein. Først tilstrækkelig ekstraktion af proteiner, er det vigtigt at formale væv i flydende nitrogen og derefter at anvende en vævshomogenisator, som beskrevet i protokollen. Hvis en vævshomogenisator ikke er tilgængelig, kan anvendes en morter og støder. Det er også vigtigt at anvende et forhold på én til tre (eller fire) gram væv mængde ekstraktionsbuffer. Dette væv til buffer-forholdet og den høje styrke buffer, som vi foreslår, vil sikre, at pH vil forblive neutral under udpakningen. Vi fandt, at det er af særlig betydning for A. thaliana og tomat ekstraORANSTALTNINGER 52.. Beskyttelse af PTMS kan opnås ved i alle buffere passende inhibitorer af enzymer, der kan fjerne PTMS. Det er også afgørende at udføre alle trin ved 4 ° C og at prechill buffere og instrumenter. Højere udbytter af målproteinet kan opnås ved hjælp af planter, som udtrykker proteinet i tilstrækkelige mængder og ved anvendelse af høje mængder af væv (ca. 20 g). Det mest afgørende skridt for at opnå tilstrækkelige mængder af target protein er at koncentrere målproteinet ved direkte immunudfældning. Betydningen af dette trin er fremhævet af vores manglende evne til at identificere PTMS PTO efter en Prf immunoprecipitation på grund af den begrænsede mængde coimmunoprecipitated Pto (figur 2B). I modsætning hertil direkte immunopræcipitation Pto gav væsentligt mere målbare peptider (figur 2C), der fører til 80% dækning af proteinsekvensen og identifikation af PTMS (tabel 1). Vi har også strongly anbefale brug af epitop-tags for protein immunoprecipitation. I sammenligning med antistoffer mod native proteiner epitop-tags affinitetsmatrix kan give højere mængder af delvist oprenset protein. Ved hjælp af et antistof mod native Pto protein 51 (figur 2A) for immunudfældning, var vi i stand til at identificere eneste single fosforylering af de to fremherskende phosphoryleringssteder i Pto.
Denne protokol er primært udviklet til delvis oprensning af N. benthamiana cytoplasmatisk protein og efterfølgende identifikation af deres phosphoryleringssteder. Men ved hjælp af de ændringer, der er beskrevet heri, denne protokol kan nemt tilpasses til A. thaliana proteiner og membran-bundne proteiner. Hovedformålet med denne protokol er at give tilstrækkelige mængder af målproteinet til identifikation af PTMS og ikke for at opnå den højeste renhed af komplekset. Hvis højere renhedaf komplekset kræves et andet trin af oprensningen kan føjes til denne protokol 52.. I dette tilfælde vil i første omgang give eluering af målproteinet fra affinitetsmatricen uden anvendelse af høje salte eller syre og det efterfølgende trin kan medføre en matrix, som kræver hårde elueringsbetingelser. Det er vigtigt at understrege, at vi kun har testet denne protokol til identifikation af phosphoryleringssteder og at vi tester i øjeblikket sin evne til detaljeret identifikation af yderligere PTMS.
Vores repræsentative resultater viser klart phosphoryleringssted plasticitet proteinkinaser og evnen af den beskrevne protokol til at karakterisere phosphoryleringssteder. Vigtigst er det, de fremhæver, at identifikation af phosphoryleringssteder afhængige i lav mængde af proteiner ved massespektrometri og ved en enkelt punktmutationer af auto-phosphoryleringssteder kan give forvirrende resultater. Vi viser her, og de tidligere 47 </sup> At dobbelt phosphorylering af Pto på Ser-198 og Thr-199 er forbundet med aktivering af Prf / Pto kompleks. I modsætning hertil har tidligere offentliggjorte resultater 47,63 vist, at en enkelt punktmutationer i Ser-198 og Thr-199 til alanin, som forhindrer fosforylering på disse sider, er i stand til at signalere tyder på, at phosphorylering af disse websteder er ikke en forudsætning for kompleks aktivering . Disse resultater kan forklares nu ved phosphorylering af den sekundære side Thr-195. Tilsvarende indsigt i phosphoryleringssite plasticitet andet protein kinase kan opnås efter denne protokol. Desuden er en kombineret metode phosphoryleringssteder punktmutationer, proteiner, der kan hæmme specifikke kinaser (effektorer) kombineret med protein immunfældning og massespektrometri-analyse vil føre til en bedre forståelse af den evolutionære betydning phosphoryleringssted plasticitet proteinkinaser.
The authors have nothing to disclose.
VN er støttet af Royal Society. JPR er en Australian Research Council Future Fellow (FT0992129). Vi takker Dr. Miriam Gifford for kritisk læsning af manuskriptet.
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
MES | Sigma | M8250 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
Sucrose | Sigma | 16104 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
D-biotin | Sigma | 47868 | |
StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |