Estudo da migração celular em Canais microfabricados

Summary

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Abstract

O método descrito aqui permite o estudo de migração celular sob confinamento numa dimensão. Ele baseia-se no uso de canais microfabricados, que impõem um fenótipo de células polarizadas por constrangimentos físicos. Uma vez que os canais internos, as células têm apenas duas possibilidades: seguir em frente ou para trás. Esta migração simplificada em que a direcionalidade é restrito facilita o rastreamento automático de células e extração de parâmetros quantitativos para descrever o movimento celular. Estes parâmetros incluem a velocidade da célula, mudanças de direcção e pausas durante o movimento. Microcanais também são compatíveis com a utilização de marcadores fluorescentes e são, portanto, adequados para estudar a localização de organelos e estruturas intracelulares durante a migração celular em alta resolução. Finalmente, a superfície dos canais podem ser funcionalizados com diferentes substratos, permitindo que o controlo das propriedades adesivas dos canais ou o estudo de haptotaxia. Em resumo, o sistema de here descrito destina-se a análise da migração de grandes números de células em condições em que tanto a geometria e a natureza bioquímica do ambiente são controlados, facilitando a normalização e reprodutibilidade de experiências independentes.

Introduction

A migração é uma função celular complexa que é importante para diversos processos fisiológicos em organismos multicelulares, incluindo o desenvolvimento, respostas imunitárias, e a regeneração de tecidos. Além disso, certas situações patológicas, tais como a invasão do tumor e metástases dependem de motilidade celular ^1. Por estas razões, a migração celular tornou-se um importante campo de estudo no contexto de investigação fundamental e de translação. In vivo, a maioria dos tecidos são caracterizado por uma matriz extracelular rica e elevada densidade celular. A migração celular, por conseguinte, em condições fisiológicas, ocorre num ambiente con....

Protocol

Importante: Este protocolo assume que o molde contendo a forma para os microcanais desejados já foi feita. Outras informações sobre a preparação do molde já foi publicado em ^{10 de.} Este protocolo também assume que DCs medula óssea cultura é conhecido.

1. Chip Fabrication

1. Misture o óleo de PDMS e agente de cura em um 10:1 de peso em um copo de plástico. Misturar os dois compostos completamente.
2. Lançai a mistura ao longo dos microcanais rolamento do molde. A altura total deve estar compreendida entre 0,5-1 cm.
3. Remova as bolhas de ar em uma redoma de vácuo durante 1 hora.
4. P....

Results

Em cada experimento, a superfície do PDMS revestido com uma molécula adaptado para o interesse do estudo. Figura 2 mostra os canais revestidos com uma molécula fluorescente, PLL-g-PEG, antes e após a lavagem (passo 2.4). Tal experiência permite o controlo da homogeneidade do revestimento dos canais.

Após o carregamento da célula, microscopia de vídeo pode ser realizada a seguir a migração celular. Figura 3A mostra um exemplo de DC migrando em microcanais, a .......

Discussion

Descrevemos aqui um dispositivo composto por microcanais como um método para estudar as propriedades migratórias de grande número de células em experiências individuais. Este sistema experimental imita as restrições ambientais confinados encontradas em tecidos de células migratórias endógenos. No entanto, forçando a migração de uma única dimensão, que facilita o controle automático de células e a extracção da mensuráveis ​​(Figura 5). Também mostram que o nosso dispositivo é compatível com a microscopia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polidimetilsiloxano (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Pacote de 90% de base de silicone e 10% de agente de cura
Cortador de amostras de núcleo	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diâmetro 2,5 mm
Prato com fundo de vidro	WPI	Fluorodish FD 35-100
Limpador ultrassônico	Branson Ultrasonics	Branson 200
Limpador de plasma	Harrick Plasma	PDC 32 G	Para amostras pequenas (35 pratos). Uma versão maior também está disponível
: Fibronectina de plasma bovino	Sigma Aldrich	F0895
PEG enxertado com polilisina (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254