Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Zusammenfassung

Das eingeführte Protokoll bietet ein Tool für die Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran, durch aufschlussreiche Einblicke in die komplexe Zusammensetzung unter verschiedenen Bedingungen. In diesem Protokoll wird der Ansatz durch den Vergleich der Zusammensetzung des Proteins für den zyklischen Elektronenfluss (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isoliert aus genetisch unterschiedlichen Stämmen Komplex verantwortlich demonstriert. Das Verfahren umfasst die Isolierung von Thylakoidmembranen, gefolgt von der Trennung in die Multiproteinkomplexen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, SDS-PAGE, und Immunodetektion vergleichende quantitative Massenspektrometrie (MS) basierend auf Differenzial metabolische Markierung ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) des Stämme analysiert. Waschmittel solubilisierten Thylakoidmembranen auf Saccharose-Dichtegradienten in gleichen Chlorophyllkonzentration geladen. Nach Ultrazentrifugation werden die Gradienten in Fraktionen, die durch Massen spectromet analysiert werden getrenntry zu gleichen Volumen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung innerhalb der Gradientenfraktionen und darüber hinaus, um das Migrationsverhalten verschiedener Proteine ​​zu analysieren, vor allem die Konzentration auf ANR1, CAS und PGRL1. Außerdem ist dieses Verfahren durch die Bestätigung der Ergebnisse mit Immunoblotting und zusätzlich, indem sie die Ergebnisse aus früheren Studien (die Identifizierung und PSI-abhängigen Migration der Proteine, die zuvor beschrieben wurden, einen Teil der CEF-Superkomplex wie PGRL1 FNR sein und zeigte cyt f). Bemerkenswert ist, ist dieser Ansatz für eine breite Palette von Fragen, auf die dieses Protokoll verabschiedet werden kann und beispielsweise für vergleichende Analysen von Multi komplexe Zusammensetzung aus unterschiedlichen Umgebungsbedingungen eingesetzt isoliert anzugehen.

Einleitung

Photosyntheseprozesse Thylakoidmembran von Pflanzen und Algen in einer linearen und cyclischen Modus. Während der linearen Elektronenfluss (LEF) Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII) und Cytochrom b ₆ / f letztlich Elektronen übertragen von Wasser zu NADP + ^1, was zu der Erzeugung von NADPH und ATP ^2. Im Gegensatz dazu zyklischen Elektronenfluss (CEF), die bekannt ist, um unter verschiedenen Umgebungsbedingungen, wie der Zustand 2 ³ und ⁴ anaeroben Bedingungen, Ergebnisse in der Rückreduktion des oxidierten PSI durch Injizieren von Elektronen in die Elektronentransportkette induziert werden. Dieser ....

Protokoll

1. Kultivierung von Chlamydomonas

1. Das folgende C reinhardtii Stämme wurden in der vorliegenden Studie verwendet: WT cc124, WT CW15-Arg7 (zellwand und Arginin Auxotroph), ein ΔPSI mutierten Stamm ²⁹ und ein pgrl1 Knock-out-Stamm ^4.
2. Alle Stämme wurden in Tris-Acetat-Phosphat-(TAP)-Medium ^30, bei 25 ° C mit einem kontinuierlichen Lichtstärke von 20-50 &mgr; E / m ² s und bei 120 Upm Schütteln gezüchtet. Die Kultur der ΔPSI sollten mit etwas Seidenpapier zur Belichtung von <5 uE / m ² sec gewickelt werden.
3. Die Kulturen der markierten Stämme (ΔPSI und ....

Ergebnisse

Das eingeführte quantitative Proteomik Ansatz zielt darauf ab, die Zusammensetzung des Multiproteinkomplexen in Thylakoidmembranen durch die vergleichende Analyse der CEF-Superkomplex-Komponenten in genetisch verschiedenen C nachgewiesen charakterisieren reinhardtii Stämme. Das beschriebene Verfahren wurde erfolgreich von Terashima et al. ⁶ angelegt und umfasst die Isolierung der Thylakoidmembran von anaeroben Kulturen gezüchtet, gefolgt von Solubilisierung Waschmittel. Anschließend.......

Diskussion

Verschiedene quantitative Proteomik-Studien unter Verwendung von stabilen Isotopenmarkierung sind in den letzten Jahren veröffentlicht worden. In diesen Versuchen in der Regel zwei verschiedenen Proben verglichen werden, von denen eine Probe mit einem stabilen Isotop markiert. Danach Proteine ​​oder Peptide, die von den beiden Proben werden in einem gleichen Verhältnis vereinigt und gemeinsam weiter verarbeitet ^48. Solche Studien wollen oft definiert isoliert zellulären Kompartimenten (zB Chloroplast.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemicals
Essigsäure	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Aceton	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Acetonitril Optigrade fü r LC-MS	Diagonal	9340	Schädlich, mit Handschuhen arbeiten. Weitere Vorsichtsmaßnahmen finden Sie im Protokolltext. https://www.diagonal.de/
Ammoniumchlorid 15N	Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammoniumchlorid 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Ammoniumhydrogenphosphat	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
Ammoniumsulfat	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brillantblau R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-Maltosid	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Ameisensäure	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Magnesiumchlorid	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Methanol	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Phosphorsäure	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Dikaliumhydrogenphosphat	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Kaliumdihydrogenphosphat	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Natriumhydroxid	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
Saccharose	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricin	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Trypsin (Sequenzierungsgrad modifiziert) und Trypsin-Puffer	Promega	V5111	http://www.promega.de/
Equipment
)	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Zentrifugenröhrchen (14 mm x 89 mm)	Beckman Coulter	331372	für die Vorbereitung von Farbverläufen im Takahashi-Stil http://www.beckmancoulter.de/
Zentrifugenröhrchen 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	zur Vorbereitung von Thylakoid-Isolationsgradienten. http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Zentrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal Cell Couting Chamber	Diagonal	449/72	https://www.diagonal.de/
Homogenisator (Potter) 50 ml	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Stempel für Homogenisator	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultrazentrifuge (Optima XPN-80 Ultrazentrifuge)	Beckman Coulter		Website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antikörper	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html

Vernebler (BioNeb-Zelldisruptor