Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup> 15</sup> N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa
Summary
A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados por espectrometria de massa.
Abstract
O protocolo introduzido fornece uma ferramenta para a análise de complexos multiproteicos na membrana tilacoide, revelando insights composição complexa, sob diferentes condições. Neste protocolo a abordagem é demonstrada através da comparação da composição do complexo de proteínas responsáveis pela cíclico fluxo de electrões (CEF) na Chlamydomonas reinhardtii, isolado a partir de estirpes geneticamente diferentes. O processo compreende o isolamento de membranas de tilacóides, seguida pela sua separação em complexos multiproteicos por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, SDS-PAGE, espectrometria de imunodetecção e comparativa, quantitativa de massa (MS) com base na marcação metabólica diferencial (14 N / 15 N) do cepas analisadas. Tilacóides solubilizados detergentes são carregados em gradientes de densidade de sacarose na concentração igual clorofila. Após ultracentrifugação, os gradientes são separados em fracções, as quais foram analisadas por massa spectrometry baseado em igual volume. Esta abordagem permite a investigação da composição dentro das frações de gradiente e, sobretudo, para analisar o comportamento de migração de proteínas diferentes, com especial incidência sobre ANR1, CAS, e PGRL1. Além disso, este método é demonstrado pela confirmando os resultados com immunoblotting e, adicionalmente, apoiando as descobertas de estudos anteriores (a identificação e a migração dependentes do PSI de proteínas que foram previamente descritos para fazer parte da CEF-supercomplex como PGRL1, FNR, e cit f). Notavelmente, esta abordagem é aplicável para tratar uma ampla gama de questões para as quais este protocolo podem ser adotadas e, por exemplo utilizados para análises comparativas de composição complexa multiprotein isolado de condições ambientais distintas.
Introduction
Processos fotossintéticos em tilacóides de plantas e algas podem funcionar de modo linear e cíclica. Durante o fluxo de elétrons linear (LEF) fotossistema I (PSI), fotossistema II (PSII) e citocromo b 6 / f em última análise, transferir elétrons da água para o NADP + 1, o que leva à geração de NADPH e ATP 2. Em contraste, cíclico fluxo de elétrons (CEF), que é conhecido por ser induzida sob diversas condições ambientais, como o estado 2 3 e 4, as condições anaeróbias resulta na redução de re do PSI oxidados através da injeção de elétrons de volta para a cadeia de transporte de elétrons. Este processo pode ocorrer tanto no lado do estroma do citocromo b 6 / f complexo 1 ou na piscina plastoquinona 5 e gera ATP, mas não NADPH 2.
O objectivo do protocolo apresentado serve para demonstrar a espectrometria de massa (MS) m baseadoétodo para a análise comparativa e quantitativa de complexos multiprotein em tilacóides de Chlamydomonas reinhardtii para obter insights sobre a composição destes complexos em condições diferentes (exemplificadas comparando linhagens geneticamente diferentes). Esta abordagem foi aplicada em uma publicação por Terashima et al., Em 2012, mostrando uma Ca 2 +-regulação dependente da CEF em C. reinhardtii mediada por um complexo multiproteico, incluindo as proteínas do CAS, ANR1, e PGRL1 6. O procedimento será explicado por comparativamente a análise da composição de CEF-supercomplex em duas estirpes geneticamente diferentes, tirando assim partido de rotulagem uma das duas estirpes com azoto pesado (15 N). Resumidamente, o protocolo inclui a preparação de membranas de tilacóides, seguido de solubilização detergente e fraccionamento de complexos fotossintéticos em um gradiente de densidade de sacarose. Após o fracionamento do gradiente, frac selecionadoções de duas estirpes são misturadas com base no volume igual, separadas por SDS-PAGE seguido por digestão em gel e subsequente análise por MS quantitativa.
Como mencionado acima, a CEF é induzida em diferentes condições ambientais e uma publicação de 2010 demonstra o isolamento de um funcional CEF-supercomplex de estado 2 de células bloqueadas C. reinhardtii 7, a qual foi realizada por separação tilacóides solubilizados em um gradiente de densidade de sacarose durante a ultracentrifugação. Diferente do Iwai et al. 7, o protocolo apresentado descreve o isolamento de CEF-supercomplex de anaeróbio crescido C. culturas reinhardtii, seguindo um procedimento alternativo. Isto inclui mudanças no protocolo de isolamento thylakoid bem como as diferenças relativas ao passo solubilização ea separação de complexos de proteínas por ultracentrifugação. No presente protocolo, tilacóidessão isolados mediante a aplicação do processo publicado por Chua e Bennoun 8, enquanto que os tampões usados para a preparação de tilacoide por Iwai et al. continha 25 mM de Mes, 0,33 M de sacarose, 5 mM de MgCl2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como descrito 9. A solubilização foi realizada com 0,7-0,8% de detergente (de n-tridecil-β-D-maltósido) durante 30 min em gelo, no caso de Iwai e colegas de trabalho, enquanto o método de solubilização descrito aqui baseia-se no uso de 0,9% de detergente (n -Dodecil-β-D-maltósido (β-MS)) e é realizado por apenas 20 minutos em gelo. Ambos os grupos utilizaram 0,8 mg de clorofila por ml para a solubilização com o respectivo detergente. Para a separação dos complexos fotossintéticos de tilacóides solubilizadas Iwai et al. Aplicadas concentrações de sacarose entre 0,1-1,3 M, ao passo que os autores deste protocolo utilizado concentrações variando 0,4-1,3 M. A última diferença é a velocidade de centrifugação, que é menor em comparação ao eApublicação rlier.
A solubilização das membranas tilacóides com detergentes não iónicos, seguido por fraccionamento de densidade de gradiente de sacarose foi já aplicado em numerosos estudos que vão desde a década de 1980 até hoje 7, 9-14 e também a aplicação da marcação metabólica das proteínas é um método generalizado no campo proteómica. A abordagem descrita aplica-se a marcação metabólica 15N para uma das duas estirpes por cultura de comparação que, na presença de azoto pesado como única fonte de nitrogénio na forma de 15 N NH 4 Cl, o que é incorporada em todos os aminoácidos que conduzem a uma massa mudar dependendo da sequência de aminoácidos do péptido. Quando a análise de uma mistura de 14 N e 15 N dentro de um MS executado, este deslocamento de massa pode ser usada para determinar a origem da amostra, para cada péptido e o péptido relativa abundância pode ser calculada representando abundâncias relativas para o correspondenteção da proteína 15.
Numerosos estudos quantitativos sobre proteômica C. reinhardtii estão disponíveis, o que comparar uma quantidade definida de proteína para analisar as alterações do proteoma entre as condições experimentais (por exemplo, mudanças no proteoma de nutrientes devido a 16-19 ou luz estresse 20,21). Comparado a esses estudos, a abordagem atualmente apresentada volumes iguais de amostras são combinados e analisados. Esta configuração permite estudar o comportamento de migração das proteínas dentro da inclinação e, além disso, a análise da composição de diferentes complexos com respeito às estirpes investigadas.
Este método irá ser explicada pela concentração principalmente em três proteínas: O primeiro candidato é o CAS proteína sensor de cálcio localizada-cloroplasto, que foi mostrado estar envolvida na foto-aclimatação em C. reinhardtii 22. O cálcio é considerado para ser um sinal importanteção de íons para caminhos que são ativados devido a diferentes estresses bióticos e abióticos, finalmente, levando a mudanças na expressão genética e fisiologia da célula 23 e foi proposto que os cloroplastos podem contribuir para celular Ca 2 + sinalização via proteína CAS 22,24,25. A segunda proteína é ANR1 (resposta anaeróbia 1 6), uma proteína que se mostrou ser induzida em condições de crescimento em anóxicas C. reinhardtii 26. Notavelmente, CAS, bem como ANR1 foram identificadas como subunidades de CEF-supercomplex e, além disso, utilizando abordagens genéticas reversa, foi demonstrado que ambas as proteínas funcionalmente contribuir para CEF in vivo 6, suportando o seu papel como subunidades funcionais deste complexo proteína. A terceira proteína é a proteína de tilacoide PGR5-like 1 (PGRL1), que foi mostrado estar envolvidas em CEF em Chlamydomonas 4,27, bem como em Arabidopsis 5,28 e era também IDentified no trabalho de Iwai et al. 7
Esta abordagem irá ser apresentada mostrando os resultados de duas experiências diferentes: de tipo selvagem (WT) versus (vs) uma estirpe ΔPSI 29, apresentando uma deleção do gene PSAB, que codifica para uma subunidade fotossistema essencial I, que também é parte da CEF-supercomplex e WT contra um pgrl1 knock-out tensão 4. Para cada uma destas experiências, a composição quantitativa do CEF-supercomplex entre 15 N e uma deformação de 14 N-etiquetada tem sido comparado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes estudos de proteômica quantitativa, utilizando rotulagem de isótopos estáveis têm sido publicados nos últimos anos. Nestas experiências, normalmente duas amostras diferentes são comparados, de que uma amostra é marcada com um isótopo estável. Posteriormente, as proteínas ou os péptidos de ambas as amostras são combinadas numa proporção igual e ainda mais processados em conjunto 48. Tais estudos, muitas vezes a intenção de comparar os compartimentos definidos isoladas ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MH reconhece o apoio da "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Autor contribuições: MH investigação destinada; KT, JS e MT realizado pesquisas e analisados os dados; KT e MH escreveu o jornal.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
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